空肠弯曲菌mcp1/2/3基因与细菌体外趋化和宿主体内定植的相关性

摘要

目的：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)经肠道感染，引起以腹泻为主的急性肠炎，也可导致反应性关节炎和Guillain-Barrre综合征等并发症，故该菌是重要的食源性病原菌。空肠弯曲菌依赖鞭毛的定向趋化运动，穿越粘膜表面粘液层到达空肠及回肠黏膜细胞表面定植，然后大量繁殖引起疾病，近年文献报道，不少细菌定植趋化运动受趋化(chemotaxis，che)相关二元信号系统(two-componentsystems，TCS)调控，通常呈MCPs→Ches→Flis/Mots三级调控模式。MCPs即接受甲基趋化蛋白( methyl-accepting chemotaxis proteins，MCPs)，是接受外界趋化信号的受体。已知空肠弯曲菌NCTC11168株基因组中含所有che相关TCS基因22]，但至今尚无相关研究报道。本研究克隆并构建了空肠弯曲菌NCTC11168株mcpl-mcp3基因并在大肠杆菌中表达，制备了重组表达产物rMCP1-MCP3抗血清及其IgG F(ab’)2，参照Huqdahl等介绍的硬琼脂法(hard agar plus，HAP)建立了空肠弯曲菌体外趋化模型，并对脱氧胆酸钠(DOC)等12种物质诱导空肠弯曲菌体外趋化的作用进行了研究，同时构建了mcp1-，mcp2-，mcp3-和mcpl- mcp2-变株，并利用HAP法检测突变株对DOC趋化能力的变化，最后用分别用野生株和突变株感染小鼠，观察其定植小鼠能力的变化。希望以上工作能为进一步阐明空肠弯曲菌che相关TCS信号传导及其调控机制提供一定的依据
　　 方法：PCR扩增mcpl、mcp2和mcp3基因片段，T-A克隆后测序。构建上述目的基因原核表达系统，采用SDS-PAGE和BioRad凝胶成像分析系统检查目的重组蛋白rMCP1、rMCP2和rMCP3的表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯rMCPs。rMCPs免疫家兔获得抗血清，采用免疫扩散法测其效价。用饱和硫酸铵盐析法和DEAE-32离子交换法提纯IgG，经胃蛋白酶酶解和Sephadex G-100层析制备IgG F(ab’)2。利用同源重组构建mcp1-mcp2-，mcp3-和mcpl-mcp2-变株。建立HAP(hard-agarplus)法空肠弯曲菌体外趋化模型并检测8种物质的趋化诱导作用。采用基于IgGF(ab’)2封闭的趋化阻断试验及mcp突变株与野生株趋化的差异性，确定不同MCPs的功能及其差异。建立空肠弯曲菌感染小鼠的模型，用银染及涂板计数的方法观察野生株和突变株定植小鼠能力的差异，以确定不同MCPs在定植小鼠时相关系。
　　 结果：PCR扩增获得预期大小的mcp1、mcp2和mcp3基因片段，其核苷酸和氨基酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能有效地表达各rMCPls，其产量均约为细菌总蛋白的10％。rMCP1、rMCP2和rMCP3免疫家兔后能产生特异性抗体，其免疫扩散效价均为1:4。牛胆汁和脱氧胆酸钠(DOC)对空肠弯曲菌趋化有浓度依赖性诱导作用(P<0.05)。MCP1和MCP2被其IgG F(ab’)2封闭后，空肠弯曲菌对DOC的趋化能力明显减弱(P<0.05)，MCP3被封闭后对空肠弯曲菌趋化能力无影响(P>0.05)。mcp1-mcp2-和mcpl-mcp2-突变株对DOC的趋化环直径分别减小16％，22％和51％。mcp1-，mcp2-和mcpl--mcp2-突变株定植小鼠的能力跟野生株相比也明显减弱。
　　 结论：DOC为空肠弯曲菌较强的体外趋化引诱物质，MCP1和MCP2可能为空肠弯曲菌对DOC趋化过程中特异受体。