苦瓜蛋白MAP30的克隆、表达及其抗病毒作用研究

摘要

目的：通过分子生物学的方法从苦瓜中克隆和表达了MAP30，并对其在哺乳细胞内的转运途径和抗病毒机制进行了初步的研究，旨在揭示其抗病毒和抗肿瘤作用的机制。
　　 方法：从成熟苦瓜种子中提取其基因组DNA，通过PcR的方法扩增出MAP30基因的全长，并将其连入原核表达载体pET30a，转入E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达3-5 h，离心收集菌液，超声破碎分析上清和沉淀，并选用Ni-NTA进行亲和纯化。于浙江大学动物房购买健康的新西兰雄兔2只，用免疫学方法制备MAP30的多克隆抗体，初次免疫用1 mg MAP30和等量的弗氏完全佐剂，再次免疫用0.5 mgMAP30和等量的弗氏不完全佐剂每隔两周免疫一次，一共四次。免疫前，兔子耳缘静脉采血，分离血清为对照，免疫后血清ELISA法测抗体的效价，Western blot测抗体的特异性。采用MTT方法检测MAP30对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤作用，并用此方法比较MAP30对转入HBV的H印G2细胞和其原型H印G2细胞的细胞毒性。分析MAP30、天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)、拉米夫定对HepG2.2.15的细胞毒性，选取其对细胞毒性最小的浓度范围进行HBV抑制的体外实验。ELIsA方法检测MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg的抑制作用，Real-time PCR方法检测其对HBV DNA的抑制作用。并在不同离子作用下，检测MAP30对DNA的切割作用。免疫电镜的方法观察MAP30在哺乳动物细胞内转运途径。
　　 结果：通过PCR方法克隆出MAP30的基因，测序结果与文献报导的相符。通过IPTG诱导表达，得到了一条分子量约为34 kD的目的条带，以可溶性和包涵体两种形式表达，可溶性含量较多。上清经过镍柱亲和纯化，用不同浓度梯度的咪唑进行洗脱，在100mM咪唑中洗脱下较纯的MAP30，透析除去咪唑，Bradford法测浓度后，过滤除菌，-20℃保存。ELISA法测抗体的效价为128000，Western blot测抗体的特异性发现除了34kD的目的条带外，还有一条分子量约为MAP30两倍的条带，经检测，其为MAP30的二聚体。MAP30对肿瘤细胞Hela、HepG2的毒性远大于对正常细胞LO2的细胞毒性，SPSS软件计算MAP30对癌细胞HepG2和Hela细胞的IC50分别为8.28μg/ml和6.92μg/ml；对LO2细胞，MAP30的IC50大于400μg/ml。MAP30对转入HBV的HepG2.2.15细胞毒性要小于原型HepG2细胞。在浓度为0.1-100μg/ml下，MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15的细胞毒性均低于15％。在此浓度下，MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA均有抑制，其抑制作用具有剂量依赖性。MAP30能将超螺旋DNA切割成缺口环状或线性DNA，并具有剂量依赖性。在不同离子作用下，MAP30对DNA的切割作用不同。免疫电镜的方法直接观察到了MAP30在细胞内主要集中于细胞核。MAP30作用细胞后，电镜观察到细胞自噬体形成。
　　 结论：MAP30对肿瘤细胞的毒性大于对正常细胞的细胞毒性。MAP30对转染HBV的HepG2.2.15细胞的毒性要小于原型HepG2细胞的细胞毒性。在低毒性剂量下，MAP30具有抑制HBV的作用，其抑制作用具有剂量依赖性。MAP30进入细胞后，可以运输进入细胞核，从而干扰病毒的复制，其可能的作用机制为MAP30对细胞核内的DNA的切割作用。MAP30作用细胞后，有可能诱导细胞自噬。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

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致谢

1引言

2主要仪器

3主要材料

4主要试剂

5基本操作

5.1植物基因组DNA抽提

5.2 CaC1 2法制备感受态细胞

5.3质粒DNA小量制备

5.4琼脂糖凝胶电泳

5.5切胶回收DNA

5.6聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

5.7 MTT法测细胞毒性

6实验方法

6.1 PCR扩增MAP30

6.2 TA克隆的构建

6.3重组子的鉴定

6.4 pET30-MAP30表达栽体的构建和鉴定

6.5 MAP30的小量表达及可溶性分析

6.6 MAP30的纯化

6.7 MAP30的细胞毒性测定(MTT法)

6.8 MAP30多克隆抗体的制备

6.9 MAP30的抗乙肝病毒作用

6.10 MAP30 DNase活性测定

6.11免疫电镜观察MAP30在肿瘤细胞Hela细胞中的分布

7实验结果

7.1 MAP30基因片段的扩增

7.2 TA克隆的构建与鉴定

7.3表达载体的构建与鉴定

7.4 MAP30的表达和纯化

7.5 MAP30细胞毒性试验

7.6 DNA酶活性试验

7.7 MAP30多克隆抗体效价和特异性测定

7.8 MAP30的乙肝抑制试验

7.9免疫电镜

8讨论

9结论

参考文献

综述：苦瓜核糖体失活蛋白研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果