苦瓜抗HIV毒蛋白MAP30基因的克隆及原核表达

摘要

Ⅰ型核糖体失活蛋白MAP30，是从苦瓜种子和果实中分离纯化的一种HIV病毒抑制剂，具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌作用。 本文根据已发表的MAP30基因的序列比对结果，采用PCR法从精选白皮苦瓜(JX)、穗农早优苦瓜(ZY)、碧翠苦瓜(BC)、银田长白苦瓜(YT)和银田蓝山大白苦瓜(LAN)5个品种中克隆得到5个长度均为861bp的MAP30基因，即JX-MAP30、ZY-MAP30、LAN-MAP30、BC-MAP30(Genebank accession No：DQ643967)和YT-MAP30(DQ643968)，其中除BC-MAP30和YT-MAP30基因与已报道的MAP30基因(AJ294541)不同，存在变异位点外，其余均相同。 因此，本研究重点对BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸以及推测的氨基酸序列进行了分析，并利用生物信息学方法对其蛋白质二级结构作了预测。此外，还对YT-MAP30基因的完整编码区(YT<,f>)和成熟蛋白编码区(YT<,m>)片段同时进行了原核表达工程菌的构建、表达条件的优化以及表达产物的SDS-PAGE检测、可溶性分析和蛋白质杂交分析等研究工作。其主要结果如下： 1．序列分析表明，BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸序列与已报道的MAP30基因分别存在2个和3个碱基的不同，但均编码263个氨基酸残基组成的成熟蛋白。 2．BC-MAP30和YT-MAP30基因的推导氨基酸序列与其他葫芦科植物的Ⅰ型核糖体失活蛋白以及天花粉毒蛋白、多花白树毒蛋白、肥皂草毒素蛋白的氨基酸序列同源性分别为68.90％、82.75％、71.25％和66.45％，且其第90～220位氨基酸序列较为保守。利用生物信息学进行的二级结构预测表明，在：BC-MAP30和YT-MAP30蛋白的整个二级结构中，无规则卷曲含量最高，其次是α-螺旋和β-折叠。信号肽区富含α-螺旋和无规则卷曲；N-端区富含β-折叠和无规则卷曲；高度螺旋区富含α-螺旋；C-端则富含无规则卷曲。 3．DNA测序结果表明，在重组表达质粒中，YT<,f>-MAP30和YT<,m>-MAP30的序列和插入位点正确。SDS-PAGE分析结果显示，pET-YT<,m>/MAP30-BL21 工程菌在30℃、1mmol/L IPTG诱导4h后，在35kD处出现一条增加的表达蛋白条带，且以可溶形式表达。 4．蛋白质分子杂交表明，重组蛋白对鼠抗：His-tag多克隆抗体具有特异抗性。 5．pET-YT<,f>/MAP30-BL21工程菌经不同诱导时间、诱导温度和不同浓度诱导物IPTG诱导，SDS-PAGE分析均无特异的表达蛋白条带出现，表明YT<,f>-MAP30信号肽的存在影响其在E．coli BL21(DE3)PlysS系统中的原核表达。