利用玉米秸秆水解液发酵生产2，3-丁二醇

摘要

2,3-丁二醇是重要的化工原料及液体燃料，利用生物质转化生产2,3-丁二醇是替代传统化工合成的一种可行途径。由于石油资源的日渐紧缺，利用廉价的木质纤维作为原料发酵生产2,3-丁二醇更具有竞争力和应用价值，本文以玉米秸秆作为初始原料，研究了预处理、纤维素酶解、单批发酵、分批补料发酵、同步糖化发酵等各环节的关键技术参数，研究结果对于促进非粮食原料的生物转化利用具有重要意义。
　　 对玉米秸秆的预处理技术进行了研究，结果表明：稀酸处理可以脱除大部分的半纤维素，稀碱处理可以脱除大部分的木质素。纤维素酶水解实验结果表明：碱处理后玉米秸秆酶解液中的单糖含量较高，主要得益于木质素的高脱除，以及润张后的纤维素成分更容易被纤维素酶所降解，稀碱预处理是一种有效的预处理方案。
　　 预处理过程引入了无机盐，当代表性无机盐Na2SO4浓度低于20g/L时，对后续发酵无明显影响。乙酸和乙醇是主要的发酵副产物，当浓度分别超过20g/L和5g/L时，会对菌株生长产生明显抑制作用。
　　 发酵适宜的初始pH值为6.0～6.5，总糖浓度为80～100g/L。产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca ZU-03利用秸秆纤维素水解液单批发酵实验表明，在总糖浓度80 g/L，30℃的条件下发酵64 h，总糖利用率可达到99.36％，2,3-丁二醇的质量浓度为37.20 g/L，产率为0.468 g/g，达到理论产率的93.6％。在此过程中实现了来自半纤维素和纤维素的五碳糖和六碳糖的共利用。
　　 单批发酵中出现的底物抑制瓶颈可以通过分批补料策略来克服。研究表明12h是比较合适的补料起始时间，比较合适的单次补料量是15 g/L。补料成分的较佳碳氮比为16，连续发酵204 h产物浓度达到100.14 g/L，最高产量达到108.13g/L，相对于单批发酵，产量提高了190.7％，通过分批补料操作获得了较高的产物浓度，对于降低下游的分离成本具有实际价值。
　　 同步糖化发酵法(Simultaneous saccharification and fermentation，SSF)生产2,3-丁二醇整合了酶解和发酵两个重要环节，不但省去了酶解液处理步骤，而且提高了生产效率，降低了成本。Klebsiella oxytoca ZU-03利用纤维原料同步糖化发酵生产2,3-丁二醇的适宜的温度为31℃，初始pH值为6.0，纤维素酶的合适用量为25 FPIU/g底物，纤维二糖酶用量是20 CBIU/g底物，SSF进行36 h，发酵液中2,3-丁二醇的浓度为23.30 g/L，产率为0.23 g/g底物。
　　 利用玉米秸秆水解液发酵生产2,3-丁二醇，实现了农业废弃物的再利用。和化学合成相比，生物转化过程相对比较温和，因此对设备的损耗和能源的需求较低。发酵得到了有用的化合物2,3-丁二醇。此过程的研究为促进可降解废弃物的生物转化和利用开拓了一个新的方向。

目录

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致谢

第一章 文献综述

1.1 2,3-丁二醇概况

1.1.1微生物生产2,3-丁二醇的代谢途径

1.1.2 2,3-丁二醇生产的菌种

1.1.3 2,3-丁二醇生产底物的选择

1.2影响微生物发酵生产2,3-丁二醇的因素

1.2.1 pH值的影响

1.2.2温度的影响

1.2.3溶氧对于发酵的影响

1.2.4添加因子对于发酵的影响

1.3纤维素原料的生物利用

1.3.1纤维素酶的生产

1.3.2木质纤维原料

1.3.3纤维原料的预处理

1.3.4纤维素的酶法糖化

1.3.5 2,3-丁二醇生产菌种和纤维原料分解菌种的共培养

1.4基因工程改造菌株在2,3-丁二醇生产过程中的应用

1.5 2,3-丁二醇的分离研究

1.6国内2,3-丁二醇的生产研究情况

1.7生物法生产2,3-丁二醇的展望

1.8本论文的研究思路

第二章 玉米秸秆的预处理和酶解

2.1材料与方法

2.1.1原料与试剂

2.1.2实验方法

2.2结果与讨论

2.2.1稀硫酸预处理

2.2.2氢氧化钠碱预处理

2.2.3酸处理和碱处理的比较

2.2.4碱处理残渣的酶解进程

2.3小结

第三章 利用玉米秸秆水解液发酵生产2,3-丁二醇

3.1材料与方法

3.1.1材料与试剂

3.1.2菌种

3.1.3玉米秸秆水解液的制备

3.1.4培养基

3.1.5实验方法

3.2实验结果与讨论

3.2.1酶解液中葡萄糖和木糖的比例变化对于发酵的影响

3.2.2玉米秸秆水解液中硫酸钠浓度对于2,3-丁二醇发酵的影响

3.2.3乙酸对发酵的影响

3.2.4副产物乙醇对于玉米秸秆水解液发酵生产2,3-丁二醇的影响

3.2.5初始pH值对发酵的影响

3.2.6玉米秸秆水解液浓缩后总糖浓度对发酵的影响

3.2.7 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵产2,3-丁二醇的时间进程

3.3结论

第四章 分批补料发酵生产2,3-丁二醇

4.1材料与方法

4.1.1材料与试剂

4.1.2纤维原料及预处理

4.1.3玉米秸秆水解液的制备

4.1.4培养基

4.1.5摇瓶发酵和补料操作

4.1.6补料量不同时补料方案

4.1.7补料成分中碳氮比不同时补料方案

4.1.8分析检测方法

4.2实验结果与讨论

4.2.1初始补料时间的确定

4.2.2 2,3-丁二醇补料发酵中合适的单次补料量

4.2.3氮源对于补料的影响

4.3结论

第五章 纤维素原料同步糖化发酵生产2,3-丁二醇

5.1材料与方法

5.1.1主要仪器与试剂

5.1.2菌种及保藏

5.1.3纤维原料及预处理

5.1.4酶制剂

5.1.5培养基

5.1.6菌种的制备

5.1.7同步糖化发酵(SSF)

5.1.8分析方法

5.2实验结果与讨论

5.2.1同步糖化发酵关键因子温度的确定

5.2.2同步糖化发酵关键因子pH的确定

5.2.3同步糖化发酵关键因子纤维素用量的确定

5.2.4纤维二糖酶用量的确定

5.2.5同步糖化发酵的进程

5.3结论

第六章 结论与建议

6.1结论

6.2展望

论文发表情况

参考文献