中国番茄黄化曲叶病毒AV2基因功能研究

摘要

中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(Tomatoyellow leaf curl China virus,TYLCCNVY10)为双生病毒科菜豆金色花叶病毒属成员,已发现其在番茄和烟草等作物上造成严重危害。TYLCCNV Y10的基因组为单链环状DNA分子,大小约为2.7 kb,共编码六个蛋白,其中一个348 bp ORF编码AV2蛋白,本论文研究发现该蛋白是RNA沉默抑制子。用pET-32a原核表达载体在大肠杆菌中表达了TYLCCNV Y10 AV2蛋白,以Ni2+-NTA亲和柱纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备了TYLCCNV Y10 AV2蛋白的多克隆抗体。含有AV2和GFP基因的植物表达载体经农杆菌共浸润GFP16c本氏烟叶片,浸润后6天(6 dpi)在紫外下观察发现浸润区有明显绿色荧光,且浸润区周围有红晕,说明AV2具有抑制GFP16c本氏烟GFP基因局部沉默的功能,但其不能抑制细胞到细胞的短距离沉默信号的传导。而且,在共浸润后30天时紫外下观察发现,GFP16c本氏烟的系统叶仍发绿色荧光,说明AV2具有抑制GFP16c本氏烟GFP基因系统沉默的功能。进一步用农杆菌浸润实验发现AV2能抑制GFP16c本氏烟GFP基因系统沉默信号的传导。上述研究结果表明TYLCCNV Y10 AV2蛋白是RNA沉默抑制子。通过农杆菌浸润本氏烟进行AV2瞬时表达,在浸润48小时后在共聚焦显微镜下观察发现,AV2蛋白分布在细胞质中,并聚集成不规则的细胞质小体。将AV2构建到PVX的表达载体pGR106上,经农杆菌浸润本氏烟后5天会引起叶片的黄脉,后期引起退绿、皱缩、坏死斑、坏死等症状,表明在PVX异源表达系统中AV2蛋白是致病因子。进一步Northern blot分析发现5dpi和7 dpi浸润pGR106-AV2的本氏烟叶片PVX的含量均比浸润空质粒对照pGR106的叶片高。推断可能是因为AV2抑制了植物抗病毒的RNA沉默,使得PVX在本氏烟内大量繁殖。

目录

致谢

摘要

Abstract

第一章 文献综述

第一节 双生病毒分类及基因组结构研究进展

1 双生病毒的分类及基因组结构

第二节 病毒编码的RNA沉默抑制子研究进展

1 RNA沉默简介

2 病毒编码的RNA沉默抑制子

3 RNA沉默抑制子的鉴定方法

4 病毒编码的RNA沉默抑制的分子作用机理

5 双生病毒编码的RNA沉默抑制子

6 病毒编码的RNA沉默抑制子的应用

第二章 中国番茄黄化曲叶病毒AV2基因的原核表达及多克隆抗体制备

1 材料与方法

1.1 质粒载体及菌株

1.2 酶及生化试剂

1.3 TYLCCNV Y10AV2基因的克隆

1.4 TYLCCNV Y10 AV2基因原核表达质粒的构建

1.5 TYLCCNV Y10 AV2基因的诱导表达、纯化及融合蛋白的鉴定

1.6 SDS-PAGE和Western blot

1.7 重组蛋白的多抗血清的制备

2 结果与分析

2.1 TYLCCNV Y10 AV2基因的克隆及序列分析

2.2 TYLCCNV Y10 AV2基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达、纯化

2.3 抗血清的效价

3 讨论

第三章 中国番茄黄化曲叶病毒AV2基因功能研究

1 材料与方法

1.1 植物材料、质粒载体、菌株及抗体

1.2 载体构建

1.3 农杆菌共浸润接种

1.4 GFP荧光观察和拍照

1.5 植物可溶性总蛋白样品的制备

1.6 SDS-PAGE和Western blot

1.7 RNA大量提取和Northern blot分析

1.8 沉默抑制子抑制信号传导的浸润方法

1.9 AV2蛋白的亚细胞定位

2 结果与分析

2.1 TYLCCNV编码的AV2蛋白能抑制GFP 16c转基因本氏烟的局部沉默

2.2 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白能抑制GFP 16c转基因本氏烟的GFP基因系统沉默

2.3 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白能抑制GFP 16c本氏烟的GFP基因系统沉默信号的传导

2.4 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白不能抑制GFP 16c转基因本氏烟中短距离沉默信号的传导

2.5 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位

2.6 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白在PVX异源表达系统中是症状决定因子

3 讨论

附 齿兰环斑病毒多克隆抗体制备及应用

1.材料与方法

1.1 病毒、质粒载体及菌株

1.2 酶及生化试剂

1.3 ORSV外壳蛋白基因(CP)的克隆

1.4 ORSV CP基因原核表达载体的构建

1.5 ORSV CP基因的诱导表达、纯化及融合蛋白的鉴定

1.6 重组蛋白的多抗血清的制备

1.7 Dot-blot ELISA检测方法的建立及检测应用

1.8 免疫捕获反转录PCR(IC-RT-PCR)的建立及检测应用

2 结果与分析

2.1 ORSV CP基因的克隆及序列分析

2.2 ORSV CP基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达、纯化

2.3 抗血清的效价和特异性

2.4 Dot-blot ELISA的建立及检测ORSV应用

2.5 检测ORSV的IC-RT-PCR方法的建立及应用

3 讨论

参考文献

附录A:本论文所用病毒缩写及中英文对照

附录B 本论文中所用术语缩写与中英文对照

附录C 常用缓冲液及培养基配方

附录D 常用生化及分子生物学试剂与仪器

作者简历