喹唑啉化合物库内小分子促小鼠胚胎干细胞心肌分化活性筛选及相关分子事件研究

摘要

胚胎干(embryonic stem，ES)细胞能在体外不分化无限增殖，一定的培养条件提供合适微环境，可在体外分化为外、中、内胚层来源的任何类型终端细胞。已有多项研究报道有体外调控ES细胞定向分化的“药样小分子”在促分化过程中发挥重要作用，基于这样的先导化合物所得的候选药物，由于其固有的调控组织再生作用而具有很好的“成药性”。
　　 心血管疾病一直是严重影响人类健康的重大疾病之一，特别是终末期心脏疾病，缺乏有效药物治疗措施，细胞移植再生医学是一个引人瞩目的方向。已有研究证明，ES细胞体外向心肌细胞分化特异基因表达图式重演了体内心肌发育基因表达，分化得到心肌细胞具有体内正常心肌或原代培养心肌特征和功能。因此，以ES细胞体外定向分化心肌细胞为模型可反映体内心肌分化，以用于各种目的心肌分化研究，包括用于促心肌再生药筛选评价。
　　 喹唑啉类衍生物因具有广泛生物活性和结构类型多样性而倍受人们关注，其对细胞表皮生长因子EGF受体(EGFR)或EGF受体酪氨酸激酶有抑制作用，进而表现出抗癌活性，可用于抗前列腺癌、肺癌、胃癌和胆癌等。由于ES细胞与肿瘤细胞在生物学上有着许多相似性，许多分子信号通路在阻滞肿瘤细胞增殖的同时，也会对干细胞的增殖、分化产生影响，利用喹唑啉类衍生物对ES细胞进行诱导定向分化具有可能的共享信号通路分子事件，但迄今未见相关报道。故本研究对基于Iressa结构而靶向设计的喹唑啉类化合物库内小分子，进行促心肌分化活性筛选，以期获得具有较强活性的先导化合物，为用作研究干细胞移植心肌再生(myocardial regeneration)或心肌细胞重建术(cellular cardiomyoplasty)中的促细胞分化剂提供候选化合物。并初步论证选择性酪氨酸激酶抑制剂喹唑啉类化合物库内小分子是否经由酪氨酸激酶通路而启动心肌分化作用，探索该作用的相关分子事件。
　　 本研究通过将带有心肌特异性转录因子启动子及荧光报告基因的质粒转染入小鼠肿瘤干(P19)细胞，使其定向分化为心肌细胞时启动报告基因质粒即可发出荧光，通过测定荧光强弱，实时定量评价小分子促心肌分化活性。在经历筛选模式、阳性对照选择等一系列条件摸索后，建立了小分子促心肌分化活性初级筛选评价体系。分别对31个喹唑啉类化合物库内小分子进行筛选，以0.10，0.50，1.00μM三个浓度，并以DMSO为阴性对照，0.001μM全反式维甲酸(Retinoicacid，RA)为阳性对照。结果显示，喹唑啉类化合物165、62、D39和234荧光强度极显著高于DMSO组，提示具有显著促心肌分化活性。其中又以化合物62效价最高，0.1μM即有较强心肌细胞分化诱导活性；化合物D39效能最大，其诱导活性约为阴性对照的两倍。
　　 经由初级筛选所获的活性化合物165、62、D39和234，进一步经由促ES细胞心肌分化的次级筛选。利用经典的ES细胞心肌分化培养法，全程加入化合物进行促分化培养，并以显微观察拟胚体出现搏动区域作为心肌分化指标，于启动分化培养的第5+7天统计拟胚体分化率。结果发现化合物62具有诱导小鼠ES细胞定向分化心肌细胞作用，其最佳诱导浓度为0.10μM。免疫荧光检测搏动区，有大量心肌特异性蛋白α-Actinin表达，且呈现典型心肌小节形态。MTT法检测该化合物对ES细胞的毒性作用，结果未显示明显毒性，提示化合物62可能具有较好的成药性，不仅体现后续进一步研发意义，而且还存在全面深入探索促心肌分化信号通路和分子事件价值。
　　 根据初级和次级促心肌分化筛选结果，进一步对化合物62进行促心肌分化信号通路和分子事件探索，并以无明显促分化活性的化合物193作平行对照。化合物62相对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂Iressa，抑制作用明显弱，计算机辅助对接结果相一致。提示化合物62促心肌分化活性可能不完全经由EGFR通路。进一步对分化过程中Oct-4、JP2、p38、p-p38、NF-кB的表达研究，随着分化过程进行，ES细胞未分化标志蛋白Oct-4表达量明显下降，而调控细胞增殖分化的核转录因子NF-кB有明显的入核现象，提示62化合物有明显的启动ES细胞分化作用。同时如若缺失即会引起小鼠胎心发育不全而致死的JP2蛋白表达较明显上升，说明化合物62的心肌诱导作用可能与上述分子事件密切相关。通常MAPK家族蛋白p-p38激活是心肌分化的开关，而本研究发现p-p38激活现象反而有所减弱，提示化合物62的促心肌分化作用可能并非经由该通路，该结果值得引起关注。以上实验表明：
　　 1.喹唑啉类化合物库内小分子62具有较强的调控ES细胞定向分化为心肌细胞活性，且最佳诱导浓度为0.10μM。
　　 2.化合物62的促心肌分化活性可能与和核转录因子NF-кB，促JP2蛋白表达上调有密切关联，而与EGFR酪氨酸激酶及MAPK家族蛋白p-p38相关度不大。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

致谢

引言

1仪器与试剂

1.1仪器

1.2药物与主要试剂及配制

1.3细胞株

2实验方法

2.1 P19细胞复苏、培养及传代

2.2转染P19细胞的分化

2.3转染P19细胞的荧光强度检测

2.4免疫荧光技术

2.5 ES细胞支持培养

2.6 Western Blot

3.实验结果

3.1筛选模型确立及初筛结果

3.2化合物次级筛选及毒性检测结果

3.3化合物62促分化作用相关分子事件研究结果

4.讨论

5.小结:

参考文献

综述 胚胎干细胞分化为心肌细胞的相关调控细胞因子及信号通路概述

1.小鼠ES细胞分化为心肌细胞过程中特异性基因和蛋白的表达

2.调控小鼠ES细胞分化为心肌细胞的细胞因子及相关信号通路

3.调控ES细胞分化为心肌细胞相关信号通路的研究意义

参考文献

作者简历及在学期间所取得的科研成果