高效棉酚降解菌株的筛选鉴定及其差异蛋白质组学研究

摘要

棉籽饼粕是一种重要的植物蛋白饲料资源，但是其中含有一种对动物有害的抗营养因子—棉酚，从而限制了其在饲料中的应用。目前，现有的一些脱毒方法，如有机溶剂萃取、硫酸亚铁处理、微生物发酵等，对棉籽饼粕的解毒起到了一定的作用。尤其是微生物发酵降解棉酚，不仅可使棉籽饼粕脱毒，同时还可提高棉籽蛋白的营养价值。虽然棉籽饼粕发酵脱毒优点已被公认，但是迄今为止，人们对微生物发酵脱毒的分子机理尚不清楚。本研究以纯棉酚为碳源，从土壤中筛选了2株棉酚降解菌，采用形态学观察及分子生物学方法进行菌种鉴定，通过分析棉酚降解菌的培养条件对其生长特性进行初步探讨，并利用蛋白质组学技术分析棉酚降解菌在不同碳源中的蛋白质表达差异。主要研究结果如下：
　　 1.以醋酸棉酚为唯一碳源，从土壤中筛选棉酚降解菌。从平板上得到2株高效降解棉酚的菌体，分别命名为AN-1、MM-2。从形态上观察及电镜结果显示：AN-1和MM-2均为丝状真菌。通过分子生物学方法对棉酚降解菌进一步鉴定表明：AN-1的18S rDNA序列与黑曲霉(Aspergillus niger)的同源性高达99％以上，据此推测AN-1可能属于A. niger；MM-2的18S rDNA序列与镰刀霉属(Fusarium)的同源性达98％以上，据此推测MM-2可能属于Fusarium sp.。
　　 2.对分离到的棉酚降解菌进行培养特性研究，以获得其最佳生长条件，为进一步研究奠定基础。生长曲线试验结果显示：棉酚降解菌AN-1和MM-2表现出相似生长趋势，即在葡萄糖中生长优于在棉酚中生长，培养60～84 h取种用于研究最好。温度试验结果显示：棉酚降解菌AN-1和MM-2在棉酚及葡萄糖中的生长情况类似，即30℃时菌体生物量达最大值，且在葡萄糖中的生长略好于棉酚。pH试验结果显示：棉酚降解菌AN-1和MM-2在葡萄糖和棉酚中培养时pH值均呈下降趋势，但在葡萄糖中较之棉酚中下降明显。氮源试验结果显示：不同氮源对棉酚降解菌AN-1和MM-2的影响均有相似趋势，即在铵盐及硝酸盐中生长比在酵母膏和尿素中好，且最佳氮源为NaNO3。棉酚耐受性试验结果表明：棉酚降解菌AN-1在5种不同浓度(0.05％,0.1％,0.2％,0.4％,0.8％)的棉酚中生长时具有明显差异，且AN-1对棉酚具有极强的耐受性，确定棉酚最适添加量为0.2％。
　　 3.采用TCA/丙酮沉淀法提取棉酚降解菌AN-1在葡萄糖和棉酚中生长72h后的菌体蛋白，得到了分辨率较好的蛋白质双向电泳图谱，蛋白质分子量主要集中在25.0～66.2kDa之间，各pI段均有分布。通过PDQuest软件分析，葡萄糖凝胶图谱中平均检测到478个蛋白点，棉酚凝胶图谱中平均检测到592个蛋白点；以葡萄糖为参考胶，棉酚为碳源的2-DE图谱中平均匹配的蛋白点为293个，未匹配的蛋白点有299个，其中有51个为差异蛋白点。采用MALDI-TOF MS方法对差异蛋白点进行质谱鉴定，获得了47张PMF图谱，鉴定出其中20个蛋白点，包括1个kinesin,2个glycerol-3-phosphate dehydrogenase,1个citrate synthase,1个ubiquitin,1个unnamed protein和14个hypothetical protein。

目录

文摘

英文文摘

主要缩写词

第一章 文献综述

第一节 棉酚的性质及其脱毒方法研究进展

1 棉酚的性质及其检测方法

2 棉籽饼粕在饲料中的应用及棉酚对动物体的危害

3 棉酚的脱毒方法

第二节 蛋白质组学研究进展

1 蛋白质组学的历史背景

2 蛋白质组学的研究内容及研究方法

3 蛋白质组学的应用

4 展望

第三节 本论文的研究目的和意义

第二章 研究报告

第一节 棉酚降解菌的分离筛选及鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二节 棉酚降解菌的培养条件研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三节 降解棉酚菌株的差异蛋白质组学研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三章 论文提示、创新点及后续研究展望

1 提示

2 创新点

3 后续研究展望

参考文献

附录一 pUCm-T Vector

附录二 Mascot数据库在线检索界面

致谢