中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA编码的βC1与番茄寄主因子SISnRKI的互作机制研究

摘要

中国番茄黄曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是单组份双生病毒，与其相伴随的卫星betasatellite分子--TYLCCNB是该病毒在自然寄主上引起典型症状所必需的。进一步研究发现TYLCCNB互补链上所编码的唯一的蛋白--βCl是一个RNA沉默抑制子和症状决定因子。为弄清βCl蛋白致病的分子机理，本论文对TYLCCNBβCl蛋白与番茄寄主因子的互作进行了研究。
　　 以TYLCCNBβCl蛋白为诱饵，利用酵母双杂交系统(yeast two hybridsystem，Y2H)从番茄cDNA文库中筛选与βCl蛋白互作的番茄寄主因子。将已构建好的诱饵质粒pGBKT7-βCl、番茄cDNA和线性化的质粒pGADT7-Rec共转化酵母菌株AH109，通过三缺营养缺陷型培养基和x-α-gal实验筛选，并进一步通过回转验证，最终确定SlSnRK1蛋白为与TYLCCNBβCl互作的番茄寄主因子。构建了双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)的重组质粒pβCl-YFPN和pSlSnRK1-YFPC，BiFC证实SlSnRK1和TYLCCNBβCl可以在烟草表皮细胞中互作，并且互作主要发生在细胞质中。
　　 序列分析表明，番茄SlSnRK1属于SnRK1复合体的α亚基，SlSnRK1基因全长为1545 bp，预测编码一个514 aa(约58，824 kD)的蛋白(GenBank登录号AAF66639)。通过DNAStar软件聚类分析发现番茄SlSnRK1蛋白与本氏烟SnRK1、普通烟NPK5的同源性及拟南芥的AKIN11等都有很高的同源性，分别为95％，87％和78％。进一步利用 InterProScan软件(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)分析了SlSnRK1的保守功能域，结果表明SlSnRK1蛋白主要含有丝/苏氨酸激酶结构域(kinase domain，KD)；泛素相关结构域(ubiquitin associated domain，UBA)；自我抑制序列(auto-inhibitorysequence，AIS)和C端与复合体形成有关的结构域(C-terminal domain，CTD)。
　　 在烟草表皮细胞中对SlSnRK1蛋白的亚细胞进行定位，利用农杆菌浸润法将SlSnRK1的N端融合有GFP的表达载体pCHF3-GFP-SlSnRK1在本氏烟叶片表皮细胞中进行瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察发现SlSnRK1融合蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞核和细胞质中。
　　 利用特异性引物，以提取的番茄不同器官的总RNA为模板，通过半定量RT-PCR和real-time RT-PCR测定了SlSnRK1 mRNA表达的组织特异性，SlSnRK1的mRNA在花中积累量最高，在叶中次之，而在根和茎中的积累量都较低。此外，以提取的TYLCCNV/TYLCCNB侵染的番茄叶片和接种菌株EHA105的番茄叶片总RNA为模板，通过real-time RT-PCR比较分析了SlSnRK1的mRNA积累量的差异，TYLCCNV在侵染早期能上调SlSnRK1 mRNA在番茄叶片中的积累，在显症期则对SlSnRK1 mRNA积累量无明显的影响，而在侵染后期则又下调了SlSnRK1 mRNA在番茄叶片中的积累。
　　 利用野生型(wild type，WT)本氏烟和转正义(sense)拟南芥SnRK1基因的转基因本氏烟植株进行病毒侵染效率测定，结果发现，与WT本氏烟相比，TYLCCNV/TYLCCNB侵染效率在转基因过表达SnRK1的本氏烟中明显下降，表明SnRK1可能参与了植物对病毒的防卫反应。
　　 构建了βCl、SlSnRK1以及SlSnRK1 kinase-dead突变体SlSnRK1K48R的酵母表达载体，利用snf1缺失突变的酵母菌株△snf1 BY4741进行酵母互补实验验证βCl蛋白能否在酵母细胞内抑制SlSnRK1的活性。在△snf1 BY4741酵母菌株中单独表达SlSnRK1或SlSnRK1K48R时，番茄SlSnRK1蛋白能互补酵母SNF1蛋白的功能，而失去激酶活性的SlSnRK1的kinase-dead突变体SlSnRK1K48R丧失了其互补的功能，但在△snf1 BY4741酵母菌株中共表达SlSnRK1和βCl蛋白时，βCl蛋白不能抑制SlSnRK1蛋白的互补活性，说明βCl蛋白不能抑制SlSnRK1的激酶活性。
　　 为了进一步了解TYLCCNBβCl与SlSnRK1的互作机理，对TYLCCNBβCl和SlSnRK1的激酶结构域区段(含有激酶结构域和泛素相关结构域，简称SlSnRK1-KD)分别进行原核表达和纯化，并用于体外磷酸化试验。结果证实SlSnRK1-KD激酶能够在体外条件下特异性磷酸化GST-βCl，对TYLCCNBβCl蛋白的氨基酸序列进行分析后发现，βCl33位的丝氨酸和78位的苏氨酸很可能是SlSnRK1的磷酸化位点，针对这两个位点分别设计了将两个位点分别或同时突变为丙氨酸或天冬氨酸的6个点突变。对上述点突变体蛋白与GST进行融合位丝氨酸和78位苏氨酸进行突变都能够明显降低突变体的磷酸化水平，其中33位丝氨酸突变后对磷酸化的影响相对较大，而78位苏氨酸突变后对磷酸化的影响相对较小，说明33位和78位均为SlSnRK1的磷酸化位点，但33位丝氨酸的磷酸化效率高于78位苏氨酸。
　　 针对βCl蛋白的两个主要磷酸化位点，构建了6个βCl突变的TYLCCNB突变体侵染性克隆，将突变体及其野生型TYLCCNB侵染性克隆分别和TYLCCNV组合共同接种本氏烟，发现与野生型TYLCCNB相比，组成型磷酸化的3个TYLCCNB突变体侵染性克隆的发病时间延迟，侵染效率下降，并且所引起的植株的症状减弱，表明βCl蛋白的磷酸化减弱了其作为病毒致病因子的功能。
　　 上述结果表明番茄SlSnRK1蛋白可以通过与TYLCCNBβCl互作，磷酸化βCl蛋白来减弱病毒的侵染，从而实现对病毒的防卫作用。

目录

文摘

英文文摘

致谢

1 绪论

1.1 双生病毒的特征及其致病的分子机制

1.1.1 双生病毒的基本特性

1.1.2 双生病毒的流行与危害

1.1.3 双生病毒的基因组及其编码的蛋白

1.1.4 双生病毒卫星betasatellite分子的发现及其作用

1.1.5 双生病毒致病性相关基因及其分子机制

1.1.6 结语

1.2 植物SnRK1研究进展

1.2.1 植物SnRK1的发现

1.2.2 SnRK1的分类

1.2.3 SnRK1复合体的结构

1.2.4 SnRK1的活性调节

1.2.5 SnRK1的底物识别序列

1.2.6 SnRK1的下游底物及其功能

1.2.7 结语

2 与TYLCCNB βC1蛋白互作的番茄寄主因子的筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 诱饵蛋白毒性及自激活检测

2.1.3 酵母双杂交实验

2.1.4 BiFC实验

2.2 结果与分析

2.2.1 βC1蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测

2.2.2 与βC1蛋白互作的番茄寄主因子筛选

2.2.3 酵母双杂交验证SlSnRK1与βC1蛋白的互作

2.2.4 BiFC验证SlSnRK1与βC1蛋白在植物体内的互作

2.3 讨论

2.3.1 酵母双杂交系统的选择

2.3.2 与βC1蛋白互作的番茄寄主因子的筛选

3 番茄SlSnRK1的性质研究

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 载体构建

3.1.3 同源序列比对及其保守功能域的分析

3.1.4 农杆菌浸润接种和侵染性克隆的接种

3.1.5 共聚焦显微镜观察GFP荧光并拍照

3.1.6 半定量RT-PCR和real-time RT-PCR分析

3.2 结果与分析

3.2.1 SlSnRK1蛋白与其他SNF1类激酶的相似性比较及其保守功能域分析

3.2.2 SlSnRK1的亚细胞定位分析

3.2.3 SlSnRK1组织特异性表达分析

3.2.4 TYLCCNV/TYLCCNB侵染对SlSnRK1 mRNA积累量的影响

3.3 讨论

4 植物SnRK1对TYLCCNV/TYLCCNB致病性的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 基因克隆和载体构建

4.1.3 酵母双杂交验证

4.1.4 侵染性克隆的接种

4.1.5 病毒侵染过程的观察及侵染效率的统计分析

4.2 结果与分析

4.3 讨论

5 βC1蛋白与SlSnRK1互作的机理研究

5.1 材料与方法

5.1.1 菌株和质粒

5.1.2 Over-lap PCR

5.1.3 载体构建

5.1.4 酵母互补/抑制实验

5.1.5 外源基因在大肠杆菌中的表达

5.1.6 GST融合蛋白的纯化、脱盐和浓缩

5.1.7 纯化蛋白GST标签的切除

5.1.8 SDS-PAGE蛋白电泳

5.1.9 体外磷酸化实验

5.1.10 蛋白磷酸化位点及体外磷酸化强度的定量分析

5.2 结果与分析

5.2.1 酵母互补/抑制实验

5.2.2 TYLCCNB βC1蛋白磷酸化位点的生物信息学分析

5.2.3 融合蛋白的表达纯化

5.2.4 TYLCCNB βC1蛋白是番茄SlSnRK1的磷酸化底物

5.2.5 SlSnRK1特异磷酸化TYLCCNB βC1蛋白的33-Ser和78-Thr位点

5.3 讨论

6 βC1蛋白的磷酸化对TYLCCNV/TYLCCNB致病性的影响

6.1 材料与方法

6.1.1 病毒和植物材料

6.1.2 菌株和质粒

6.1.3 磷酸化位点突变的突变体侵染性克隆构建

6.1.4 突变体侵染性克隆致病性差异分析

6.2 结果与分析

6.3 讨论

7 全文小结与展望

7.1 全文小结

7.2 展望

参考文献

附录A：本论文中所用术语缩写词及中英文对照

附录B：本论文所用病毒缩写及中英文对照

附录C：常用培养基及缓冲液配方