中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA编码的βC1蛋白的磷酸化对其抑制转录水平基因沉默的影响

摘要

中国番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是单组份的双生病毒，其伴随的卫星DNA(Tomatoyellow leaf curl China Betasatellite，TYLCCNB)编码的βC1蛋白是一个致病因子和RNA沉默抑制子，不仅能够诱导严重的病毒症状而且能够抑制甲基化介导的转录水平基因沉默(Transcriptional gene silencing，TGS)。为了抵御双生病毒的侵染，番茄中具有激酶活性的SlSnRK1[Snf(sucrose non-fermenting)-1-relatedprotein kinases1]蛋白可以通过磷酸化βC1从而减轻病毒诱导的症状。但是，目前尚不清楚βC1的磷酸化如何进一步影响其相关功能。因此，本文围绕βC1蛋白的磷酸化修饰对其抑制TGS能力的影响开展了相关研究。
　　前期的研究表明，将βC1蛋白两个潜在的磷酸化位点—第33位的丝氨酸(Serine，Ser)和78位的苏氨酸(Threonine，Thr)，分别或者同时突变为组成型磷酸化的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)，突变体的侵染性克隆在本氏烟上的发病时间延迟，侵染效率下降;而将Ser33和Thr78分别或者同时突变为不能被磷酸化的丙氨酸(Alanine，Ala)后，突变体侵染性克隆在本氏烟上的发病时间和侵染效率与野生型βC1的侵染性克隆相似。
　　为了明确βC1磷酸化是否影响βC1蛋白的表达水平，首先将构建于马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)表达载体上的6个βC1磷酸化突变体pGR106-βC1S33A、pGR106-βC1S33D、 pGR106-βC1T78A、 pGR106-βC1T78D、 pGR106-βC1S33A/T78A和pGR106-βC1S33D/T78D分别接种本氏烟，以βC1的单克隆抗体进行Western blot分析，发现βC1突变后其蛋白表达量无明显差异。进一步将PVX相关重组载体接种GFP转录水平沉默的16-TGS本氏烟，发现βC1的非组成型磷酸化突变体pGR106-βC1S33A、pGR106-βC1T78A和pGR106-βC1S33A/T78A与野生型pGR106-βC1一样可以回复GFP荧光，但是其组成型磷酸化的突变体pGR106-βC1S33D、pGR106-βC1T78D和pGR106-βC1S33D/T78D不能回复GFP荧光，表明βC1的组成型磷酸化突变体不能抑制GFP的转录水平基因沉默。
　　利用Chop-PCR实验发现，βC1非组成型磷酸化突变体侵染性克隆TYLCCNBS33A、TYLCCNBT78A和TYLCCNBS33A/T78A与野生型TYLCCNB一样可以降低其辅助病毒TYLCCNV基因组的甲基化水平，但是βC1组成型磷酸化突变体的侵染性克隆TYLCCNBS33D、TYLCCNBT78D和TYLCCNBS33D/T78D不能降低辅助病毒TYLCCNV基因组的甲基化水平，表明βC1的组成型磷酸化突变体减弱了其抑制辅助病毒TYLCCNV基因组甲基化的能力。
　　以上结果表明，βC1蛋白的组成型磷酸化突变体可能通过减弱其抑制辅助病毒甲基化的能力，从而失去了抑制甲基化介导的TGS的能力。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 双生病毒的发生、流行与危害

1．2 双生病毒的分类与基因组结构

1．3 单组份双生病毒伴随的卫星betasatellite分子的发现

1．4 双生病毒与RNA沉默

1．4．1 RNA沉默的基本机制

1．4．2 植物中的RNA沉默途径

1．4．3 双生病毒与植物RNA沉默之间的关系

1．5 TYLCCNV伴随的卫星betasatellite分子的结构和功能

1．5．1 βC1蛋白是症状决定因子

1．5．2 βC1蛋白抑制转录后水平的基因沉默

1．5．3 βC1蛋白抑制转录水平的基因沉默

1．5．4 磷酸化的βC1蛋白减弱其作为致病因子的功能

1．6 本课题的研究目的和意义

2 常规实验方法

2．1 常规克隆技术

2．1．1 PCR技术

2．1．2 PCR产物的回收

2．1．3 加A反应

2．1．4 连接反应

2．1．5 CaCl2法制备感受态细胞

2．1．6 转化

2．1．7 菌落PCR筛斑

2．1．8 质粒的提取

2．1．9 酶切验证

2．2 电击转化农杆菌

2．2．1 农杆菌感受态的制备

2．2．2 电击转化农杆菌

2．2．3 接种农杆菌

2．3 Chop-PCR

2．3．1 植物基因组DNA的小量提取

2．3．2 Chop-PCR

2．4 蛋白的SDS-PAGE及Western印迹分析

2．4．1 植物总蛋白的提取

2．4．2 SDS-PAGE及Western blot

3 TYLCCNV卫星DNA编码的βC1蛋白及其磷酸化突变体抑制TGS差异的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 病毒材料

3．1．3 βC1及其磷酸化突变体蛋白表达量的检测

3．1．4 TGS回复实验

3．1．5 16-TGS植株中GFP蛋白的检测

3．1．6 Chop-PCR检测病毒基因组的甲基化

3．2 结果与分析

3．2．1 βC1的不同磷酸化突变体诱导植株产生症状的能力有所差异

3．2．2 βC1的组成型磷酸化突变体减弱其抑制GFP转录水平基因沉默的能力

3．2．3 βC1的组成型磷酸化突变体减弱了其抑制病毒基因组甲基化的能力

3．3 讨论

4 全文小结

附文 双生病毒Y194编码的C4蛋白与烟草寄主因子NtRFP1蛋白的互作机制研究

参考文献

附录