基于新一代测序技术的生后小鼠卵巢发育过程中基因表达谱变化的研究

摘要

卵巢是雌性哺乳动物的生殖器官，具有产生成熟卵泡、分泌雌性激素等重要功能。卵巢发育是复杂的组织发生过程，其关键分子事件包括原始卵泡形成、原始卵泡启动募集和优势卵泡选择等。但迄今为止，卵巢发育的分子机制和调控机理尚未被完全阐明。基于基因芯片的卵巢基因表达谱研究可以揭示不同阶段卵巢组织中表达的基因及其表达水平，从而为分子水平研究卵巢发育调控机制提供了理论基础。然而，常规基因芯片技术存在成本昂贵、检测灵敏度低、重复性差、分析泛围窄等缺点。这使得卵巢基因表达谱研究只能限定在中高表达丰度的既有基因模型，且不能鉴定表达基因的可变剪切体，从而无法全面剖析卵巢组织基因表达谱。
　　 近3年来，基于新一代测序技术的基因表达谱研究(RNA-seq)成为转录组学研究领域的热点。大量针对模式生物的RNA-seq研究表明：与传统芯片技术相比，RNA-seq能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化转录本，具有信噪比高、分辨率高、应用范围广等优势，已经成为转录组学研究的重要实验手段。在本研究中，我们采用新一代测序技术(SOLiD)对小鼠卵巢发育的三个代表性时期（幼年期，1周龄；青春期，4周龄；成年期，8周龄）的卵巢组织进行转录组学研究，以全面了解在这三个关键时期卵巢组织中基因的表达变化情况。
　　 我们对小鼠三个时期卵巢的转录组文库利用新一代测序仪SOLiD进行了测序，并将测序所得到的序列比对到小鼠基因组上，然后参照Ensemble基因注释模型对序列进行了注释。在三个样本中，我们分别得到了12，585，638、15，652，548和17，476，893条序列专一比对到小鼠基因组上，其中专一比对到基因外显子区域的序列数分别为：1，987，750、1，919，665和5，128，962条。我们以外显子区域专一比对序列数大于等于2作为基因表达的标准，分别鉴定出16，961、17，185和18，632个基因在幼年期、青春期和成年期小鼠卵巢中表达，比基因芯片方法多检测出50％基因。基因可变剪切分析发现，在卵巢组织中有6，692个基因具有可变剪切形式，共发现5002种与Ensemble注释模型不同的可变剪切形式，并且发现一些基因的不同可变剪切体在不同发育时期的特异性表达。
　　 我们采用RPKM值衡量基因表达丰度以归一化三个文库基因表达谱，并进行了三个不同时期卵巢基因表达谱的聚类分析，结果发现幼年期和青春期的小鼠卵巢基因表达谱聚为一类，这一结果与三个发育时期的小鼠卵巢生理特征相一致。研究表明，卵泡发育过程按照其对促性腺激素的依赖性可以被分为两个阶段，第一个阶段为腔前卵泡阶段，该阶段的发育不依赖于促性腺激素；第二个阶段为有腔卵泡发育阶段，必须依靠促性腺激素的刺激才能发育至成熟卵泡。青春期和幼年期小鼠的卵巢中以第一个发育阶段的卵泡为主，而成年小鼠卵巢内则含有大量的有腔卵泡。因此，青春期小鼠卵巢的基因表达谱与幼年期小鼠卵巢表达谱更为相似的聚类结果很好地呈现了这一点。
　　 三个时期基因差异表达分析表明，434个基因在青春期小鼠卵巢与幼年期小鼠卵巢中存在显著差异表达，成年小鼠和青春期小鼠卵巢之间差异表达基因个数为4,366个。三个发育时期差异表达基因数目的差异进一步验证了三个时期基因表达谱聚类分析结果。在青春期小鼠与成年期小鼠的4，366个差异表达基因中，有4,100个基因表现为在成年期小鼠中表达丰度的上调。这表明成年期小鼠卵巢内基因表达较前面两个时期更为活跃。这些上调的基因涉及到多个生物学功能的调控，例如激素合成、能量代谢、细胞组成、信号转导和细胞凋亡调控。另外，我们发现类固醇激素合成相关基因(Cypllal、Hsd17bl、Hsd3bl)的转录活力在小鼠卵巢发育过程中持续上调。
　　 我们共发现了1，535个转录因子在三个时期小鼠卵巢中表达，这其中既有已被证明在卵巢发育过程中起重要作用的转录因子例如：Nr5al、Emx2、Nobox、Fox12、Sox3等，也有大量的在卵巢发育过程中功能未知的转录因子。另外，我们研究发现了561个低表达的转录因子(RPKM<1)，已有研究表明一些低表达的转录因子例如Figla、Lhx9和Sox3等在小鼠卵巢发育过程中发挥重要作用。这些低表达的转录因子较难被芯片方法检测到，它们的发现可以使我们更深入地了解小鼠卵巢转录组。另外，我们的数据同时发现了大量的non-codingRNA参与了卵巢的发育调控，并且可能发挥了比较重要的作用。在三个文库中共检测到1110个表达的non-coding RNA，包括snoRNA、snRNA、miRNA和miscP,NA。已有报道的在卵巢中表达的non-coding RNA基因例如mir-199a、mir-let7a、mir-let7b、mir-709和mir-26a等在我们的数据中都可以检测得到。本研究发现非编码RNA在三个文库中也存在表达差异，这些非编码RNA基因在卵巢发育过程中可能发挥了重要的作用。

目录

文摘

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引言：

第一章 文献综述

1.1 哺乳动物卵巢发育的研究背景

1.1.1 卵巢的结构及功能：

1.1.2 卵泡分类

1.1.3 卵泡发育

1.1.4 卵泡早期发育的分子调控

1.1.5 卵泡的后期发育及闭锁退化

1.2 小鼠卵巢转录组学研究

1.3 转录组学的研究方法：

1.3.1 EST表达序列标签

1.3.2 DNA微陈列

1.3.3 SAGE基因表达系列分析

1.3.4 大规模平行信号测序系统

1.3.5 上述各技术间的优缺点比较

1.3.6 RNA-seq技术及其应用

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要化学试剂

2.3 试剂盒

2.4 实验方法

2.4.1 实验材料的处理

2.4.2 RNA提取

2.4.3 核糖体RNA的去除

2.4.4 用SOLiIDTM WholeTranscriptome Analysis Kit构建建文库

2.4.5 进行SOLiD上机建库前步骤

2.5 数据分析方法

2.5.1 SOLiO,序列在基因组上的注释

2.5.2 可变剪切数据集的构建

2.5.3 基因表达谱分析

2.5.4 差异表达基因的确定及功能分类

2.5.5 转录因子在三文库中表达情况的分析

第三章 结果

3.1 转录组文库的构建

3.2 PNA-SEQ数据的性质

3.2.1 测序质量的检测

3.2.2 测序数据的注释

3.3 基因表达谱的分析

3.3.1 三文库中表达基因数量及种类的变化

3.3.2 PPKM值的计算及修正

3.3.3 mRNA编码基因的表达谱分析

3.4 基因内含子区域表达的分析

3.5 基因可变剪切的分析

3.6 三个文库表达基因的功能分类

3.7 三个文库差异表达基因的研究

3.7.1 差异表达基因的功能分析

3.7.2 差异表达基因在细胞信号通路上的变化

3.8 转录因子在不同发育时期卵巢中的表达

第四章 讨论及后续工作计划

4.1 RNA-SEQ在研究整体转录组中的应用

4.2 小鼠卵巢转录组的特点

4.3 三个发育时期卵巢差异表达基因的研究

4.4 本文创新点

4.5 后续工作计划

参考文献

英文缩略词

附录

致谢