白菜花粉异基因BcSKSII在花粉发育授受精中的表达分析及功能鉴定

摘要

花粉发育与授粉受精是一个多基因调控的复杂过程。研究表明,花粉发育基因特别是一些细胞壁相关基因持续表达并特异地调控后续的授粉受精相关过程。近年来,以拟南芥、水稻为代表的植物花粉转录组的大规模分析结果表明,成熟花粉中具有后续花粉萌发和花粉管生长过程所需的mRNA。这些存储的mRNA怎样以完整长度的形式存在并安全的度过花粉成熟和水合阶段,以及如何传递到其发挥作用的组织,仍然没有一个确切的答案。本实验室采用ATH1芯片分析了白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensis Markino var.communis Tsen et Lee)授粉受精前后雌蕊基因的表达差异,检测到一批花粉发育和授粉受精过程特异表达的细胞壁相关基因,它们在授粉后的雌蕊中上调表达,同时在白菜mmc对应的野生型中上调表达(蒋晶晶等,未发表)。其中,转录本标识为At3g13390的基因可能编码的蛋白质是一个多铜氧化酶并可能作用于花粉发育及授粉受精过程。在植物中,常见的多铜氧化酶包括抗坏血酸氧化酶、漆酶2种类型,它们对于植物的生长发育特别是植物组织器官的生长具有重要的作用,但对于其功能的研究相对较少。为了研究该基因的结构和表达特征,为进一步确定其功能打下基础,本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术和同源扩增的方法克隆基因全长,分析其序列特征并预测其蛋白质结构和功能,进而采用RT-PCR方法分析其在可育株系和不育株系中不同发育阶段的花蕾中和营养器官的表达情况,采用组织原位杂交进行该基因的细胞定位,分析其与花粉发育的关系;同时,利用拟南芥T-DNA插入突变体,比较突变体植株和野生型植株在形态、育性、花器结构、花粉形态及萌发能力等方面的差异,为阐明该基因的生物学功能提供实验证据,也为研究mRNA的储存与转运提供一定的研究基础。取得的主要成果如下:
　　 (1)在研究白菜核隐形雄性不育两用系‘Bcajh97-01A/B’花蕾的基因表达差异时,检测到一批花粉发育和授粉受精过程特异表达的细胞壁相关基因,发现了一个推定的多铜氧化酶基因,利用同源扩增、兼并引物PCR技术及3'RACE相结合的方法扩增得到了其eDNA和DNA全长。该基因DNA全长共1911 bp,ORF全长为1668 bp,包含两段内含子,且连接处均符合GT-AG规律。该基因编码555个氨基酸,其二级结构含有7.21％的α螺旋,35.68％的p折叠和57.12％的环状结构;并包含1个疏水信号肽、5个高亲水性区域以及6个N-糖基化位点、1个葡聚糖依附位点、11个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、9个N端肉豆蔻酰化位点和1个ATP/GTP连接位点模序A等生物学位点。其三维结构是由一系列loop环状结构连接的β-片层和α-螺旋组成的一个复杂结构体。通过SMART数据库分析推定该蛋白存在抗坏血酸氧化酶典型的三个结构域:Cu-oxidase3、Cu-oxidase、Cu-oxidase2,说明这是一个典型的抗坏血酸氧化酶基因。但与其他抗坏血酸氧化酶不同的是,它缺少部分铜离子连接所必需的组氨酸位点。而拟南芥中SKS基因家族、烟草NTP303基因家族成员氨基酸序列也具有相同的特征。该基因又与拟南芥SKS11序列最接近,命名为BcSKS11。此外,该基因还可能编码一个糖基化锚定蛋白。
　　 (2)为了确定BcSKS11的时空表达特点,我们利用RT-PCR技术检测了它在白菜'Bcajh97-01A/B'不育株系和可育株系5级花蕾,不育株授粉1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h后的嫩角果,可育株系开放花序、角果、根、茎、叶片,可育株系即将开放的花蕾的花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、蜜腺中的表达情况。对其在可育系花序、角果、茎、叶、根中的表达结果分析,发现BcSKS11只在花序中表达;对不育系和可育系5级花蕾进行表达分析,结果表明该基因最先表达于第4级花蕾中,即双核期;在成熟花粉中表达量最高。进而选取第4和第5级成熟花蕾的花瓣、萼片、雌蕊、雄蕊、蜜腺等组织进行RT-PCR分析,BcSKS11只在雄蕊中有较高的表达,而花蕾其他部分均未发现该基因的表达。在授粉后的嫩角果中,BcSKS11仍持续表达,随着授粉后生长时间的增加,表达也随之增加,在授粉8-12 h表达量最高,随后又下降。应用组织原位杂交方法对BcSKS11进行定位,该基因在特异表达于第5级花蕾的花粉中。
　　 (3)将拟南芥突变体采用“三引物法”筛选出纯合突变体,然后,对它们及其野生型植株的生长状况与形态进行观察,并进行相关基因表达分析。拟南芥T-DNA插入突变体植株sks11-1、sks11-2营养生长、花、嫩角果、种子、花药结构、花粉核形状均正常,并且可以正常开花、结果,与野生型相比均没有明显差异。花粉离体萌发观察时发现萌发5 h以后,拟南芥突变体及野生型花粉均能正常萌发,花粉管生长长度基本一致。但是将sks11-1与野生型花粉分别授到野生型植株的雌蕊组织中1 h以后,突变体花粉在体内萌发数量明显减少,说明SKS11可能对花粉管的体内生长有影响。通过RT-PCR分析发现,T-DNA插入导致SKS11 mRNA表达量下降,同时引起了其他基因表达量的变化。与野生型相比,在sks11-1,sks11-2中,At3g13390(SKS11)基因表达量下降;而Atlg15570(SKS12)表达量可能上升,但是趋势不明显,Atlg5560(SKS14)和At4g02250表达量有所下降,而At3g13400(SKS13)表达几乎无区别。

目录

文摘

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致谢

论文说明:缩写词

前言

1 文献综述

1.1 被子植物花粉发育与授粉受精

1.1.1 花粉发育与授粉受精过程

1.1.2 花粉壁

1.1.3 花粉mRNA转录后调控及储运

1.2 植物多铜氧化酶及其亚家族成员SKS蛋白

1.2.1 MCO的铜离子连接位点及对底物的选择

1.2.2 MCO的演化

1.2.3 MCO的生物学功能

1.2.4 缺乏BCB位点的MCO家族——SKS基因家族

1.3 拟南芥T-DNA插入突变体研究进展

1.3.1 拟南芥T-DNA插入突变体的原理

1.3.2 拟南芥T-DNA插入突变体在研究植物花粉发育及授粉受精过程中的应用

2 白菜花粉发育与授粉受精相关基因BcSKS11的克隆及序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 基因组DNA提取

2.1.3 总RNA的提取及cDNA的合成

2.1.4 PCR方法扩增基因全长

2.1.5 cDNA和DNA测序

2.1.6 序列的特征分析

2.2 结果与分析

2.2.1 获得目标基因的cDNA及DNA全长

2.2.2 BcSKS11核苷酸及氨基酸序列分析

2.2.3 BcSKS11是存在特殊结构的AAO

2.3 讨论

3 BcSKS11在白菜‘Beajh97-01A/B’中的时空表达模式分析

3.1 材料与方法

3.1.1 RT-PCR分析

3.1.2 原位杂交分析

3.2 结果与分析

3.2.1 BcSKS11基因在白菜花粉发育及授粉受精中持续表达

3.2.2 BcSKS11在花粉及花粉管中特异表达

3.3 讨论

4 拟南芥SKS11的结构、表达及功能分析

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 “三引物法”筛选纯合突变体

4.1.3 RNA分离及cDNA合成

4.1.4 RT-PCR分析

4.1.5 花粉发育的形态和细胞学观察

4.1.6 基因表达差异分析

4.1.7 分子进化树构建

4.2 结果与分析

4.2.1 SKS11、SKS12、SKS13与SKS14结构高度相似的四个同源基因

4.2.2 SKS11、SKS12、SKS13与SKS14具有相同的时空表达特点

4.2.3 拟南芥SKS11的功能分析

4.2.4 SKS11与近缘基因氨基酸序列的比较

4.3 讨论

4.3.1 SKS11、SKS12、SKS13与SKS14具有相同的基因结构及表达模式

4.3.2 SKS基因家族在植物生长发育中的作用

4.3.3 SKS11可能在花粉管生长过程中具有重要的作用

结论

参考文献

硕士期间发表的文章