胰腺实性假乳头状肿瘤的组织发生及Notch信号通路的表达研究

摘要

胰腺实性假乳头状肿瘤(solid-pseudopapillary neoplasm,SPN)是一种少见的具有低度恶性潜能的实体性肿瘤,好发于年轻女性,约占胰腺肿瘤的1～2％。过去因对其认识不足,易误诊为无功能胰岛细胞瘤,胰腺囊腺瘤,乳头状腺泡细胞癌等,但其预后较胰腺导管腺癌及胰腺内分泌肿瘤要好。
　　 近年来因对胰腺实性假乳头状肿瘤的病理形态学认识的提高以及新的免疫组化标记的广泛应用,国内外对SPN的文献报道病例明显增多,但对其组织起源及发病机理的认识尚不清楚,对其组织起源存在多种假设,有认为SPN可能起源于胰腺导管上皮细胞,有的认为SPN可能起源于胰腺腺泡细胞,有的认为来自胰腺内分泌细胞或胚胎神经嵴,也有人认为可能起源于胰腺多潜能干细胞,但目前尚无一致的结论,对胰腺SPN的组织发生的探讨是SPN研究的一大热点。
　　 2001年Taraka等报道胰腺实性假乳头状肿瘤几乎所有病例均存在Wnt—β-catenin信号通路的活化,即编码β-catenin的CTNNB1基因的3号外显子出现点突变,导致β-catenin蛋白难以在肿瘤细胞胞浆内磷酸化及降解并与Tcf／Lef形成复合物进入细胞核内,激活MYC及Cyclin D1等癌基因的转录,即Wnt-β-catenin信号通路的活化。免疫组化染色β-catenin蛋白由正常胰腺导管及腺泡细胞胞膜阳性转而在SPN肿瘤细胞呈胞浆及胞核阳性,这一染色特点对病理学诊断SPN有重要意义。但除Wnt-β-catenin信号通路以外,有无存在其它信号传导通路的改变,有无其它癌基因或抑癌基因在SPN的发生发展中起作用,近年来有关这方面的研究国内外极少有文献报道。
　　 DNA拷贝数的变化在人类遗传性疾病及肿瘤等的发生发展中起重要作用,基于微阵列技术的比较基因组杂交(aCGH)通过在一张芯片上用标记不同荧光元素的样品(肿瘤样品和对照样品)同时进行杂交,可检测样本基因组和对照基因组之间DNA拷贝数的变化,直观地表现出肿瘤及遗传性疾病基因组DNA在整个染色体组的缺失或扩增,对肿瘤而言缺失部位可能包含抑癌基因,而扩增片段则可能存在癌基因。这对于寻找与肿瘤发生相关的癌基因及抑癌基因非常有帮助,通过对SPN标本进行aCGH检测,捕获与SPN发生相关的基因进行深入的研究,对于了解SPN的发生及发展有重要意义。
　　 2003年1月至2010年6月在浙江大学医学院附属第一医院就诊并经穿刺及手术切除病理论断为SPN者共48例,为探讨SPN的组织起源我们选择病史资料完整,有随访结果及有足够肿瘤组织的SPN病例共20例进行形态学,免疫组织化学及超微结构观察,并选择同期因胰腺导管腺癌及胰腺神经内分泌肿瘤行手术切除的标本各15例作免疫组化对照,选择目前诊断SPN特异的免疫组化标记物β-catenin、E-cadherin,胰腺导管上皮标记物CKpan,胰腺腺泡细胞标记物α-1-AT,胚胎神经嵴的标记物S-100蛋白,Melan A,神经内分泌细胞标记物CgA,Syn,CD56及Secretagogin蛋白等抗体,进行免疫组化检测,结果发现,本组SPN91％为女性,平均年龄为33.4岁,肿瘤大小1.2—14CM,切面易见出血及囊性变,组织学上由粘附性差的单一的上皮样细胞形成实性及假乳头状结构,超微结构肿瘤细胞胞浆内有丰富的细胞器,主要为肿胀的线粒体及酶原样颗粒,未见神经内分泌颗粒。免疫组化所有SPN肿瘤细胞β-catenin胞浆及胞核阳性,β-catenin胞膜阴性,E-cadherin免疫组化染色显示胞膜染色完全丧失。80％SPN肿瘤细胞表达CKpan,但其染色强度与正常胰腺上皮细胞相比要弱一些,着色细胞数量与正常胰腺上皮细胞相比也要少。95％SPN肿瘤细胞表达α-1-AT,但呈小簇状及单个细胞阳性。100％肿瘤细胞CD56胞膜阳性,55％肿瘤细胞Syn胞浆阳性,但特异性的神经内分泌标记物CgA只有5％肿瘤细胞胞浆阳性,Secretagogin肿瘤细胞均阴性,S-100有1例(5％),Melan A有2例(10％)肿瘤细胞胞浆阳性,我们的形态学及免疫组化观察结果支持SPN起源于胰腺多潜能干细胞,并向胰腺外分泌,内分泌及神经外胚叶多向分化,其不同的免疫组化标记表达可能是多潜能干细胞沿不同方向或不同阶段分化的结果。
　　 为了解在SPN发生及发展过程中除Wnt-β—catenin信号通路活化外,有无其它癌基因,抑癌基因及其相关信号通路的改变,我们在检测β-catenin基因3号外显子突变的基础上,对10例SPN样本进行了高通量的aCGH检测,若将待测DNA与对照DNA荧光强度之比的log2 ratio≥0.2或≤-0.2,即相当于每个位点≥3个DNA拷贝数改变,分别作为DNA有扩增或缺失的阀值,结果在10例SPN样本中共检测到有DNA拷贝数改变的染色体区域112个,最多的一例有53个,最少的12个,平均每例22.3个,每一样本检测到扩增的区域要明显多于缺失的区域,平均每例检测到扩增区域19.5个,缺失区域3.4个,最常见的扩增区包括1p,2q,4q,5q,8p,9p,10q,11q,13q,15p,15q,16p,19q,20p,21q,22q,Xp,而缺失的区域主要位于11q,17p,20p及Y染色体上。若将Log2 ratio定于≥0.75或≤-0.75,即相当于阀值3.5倍的DNA拷贝数改变作为高水平扩增或缺失阀值,则共有58个区域检测到高水平扩增,主要是1p,2q,4q,5q,9p,10q,11q,13q,15p,15q,19q,20p,21q,22q,而缺失则位于11q及Y染色体上。对于存在高水平扩增的DNA区域,通过查找胰腺表达数据库,筛查相关的候选基因,我们发现除Wnt-β-catenin信号通路相关的几个基因位点出现扩增外,还发现Notch2所在染色体1p12区域易检测到高水平的扩增,其次为OR4F4等所在的15q26.3及OR4M1等所在的14q11区域易检测到高水平扩增。而在胰腺导管腺癌中易出现的KRAS,P53,P16及DPC4基因及CDKN2A,SMAD4,DCC等抑癌基因未能在SPN中检测到,提示在SPN的发生及发展中出现的分子遗传学改变与胰腺导管腺癌不同。
　　 SPN是一种具有低度恶性潜能的胰腺实体性肿瘤,目前尚无判断其预后的形态学金标准,我们对作aCGH检测的10例SPN标本,以①肿瘤>5CM；②出现肿瘤性坏死；③侵犯胰腺周围软组织；④脉管／神经周围侵犯；⑤核分裂像增多或增殖指数增高作为具有侵袭性特征的组织学指标,我们发现具有较多侵袭性特征组织学指标的SPN样本易检测到DNA拷贝数改变,且出现高水平扩增者要多于无侵袭性组织学特征的SPN样本。
　　 在aCGH初步筛选的基础上,为进一步探讨Notch信号通路在SPN发生发展中的作用,我们选择冷冻新鲜的SPN,PDAC,PET及正常胰腺组织样本各10例,用RT-PCR法检测了Notch信号通路的主要成分Notchl,Notch2,Notch4及Jagged-1mRNA在这些样本中的表达,并选择SPN,PDAC,PET及正常胰腺组织各20例常规石蜡存档标本,用免疫组化法检测了Notchl,Notch3,Jagged-1及CyclinD1蛋白在这些样本中的表达情况,我们发现Notch2 mRNA在SPN中表达明显上调,Notch1,Jagged-1 mRNA在SPN中表达亦上调,Notch4 mRNA的表达未见明显改变。Notch1,Jagged-1及CyclinD1蛋白在SPN中表达明显上调,而Notch3未见明显改变,提示Notch信号通路与SPN的发生有密切的关系,活化的Notch信号通路有助于维持SPN部分肿瘤细胞处于未分化的多潜能干细胞状态。Notch信号通路可能通过CyclinD1与Wnt-β-catenin信号通路协同作用,参与SPN的发生发展。免疫组化法检测Notch1及Jagged-1在SPN中呈强阳性,而在胰腺神经内分泌肿瘤中呈弱阳性或不表达,有助于我们运用此方法在日常病理论断中将胰腺神经内分泌肿瘤与胰腺实性假乳头状肿瘤鉴别开来。
　　 根据我们的实验结果,可以得出以下结论:
　　 1.胰腺SPN可能起源于胰腺多潜能干细胞,并向胰腺外分泌,内分泌及神经嵴多向分化,其不同的免疫组化标记表达可能是多潜能干细胞沿不同方向或不同阶段分化的结果。
　　 2.aCGH检测结果提示SPN除存在Wnt—β-catenin信号通路异常活化外,可能与Notch信号通路的活化有关,其发生发展中出现的分子遗传学改变与胰腺导管腺癌不同,组织学上具有较多的侵袭性特征者,aCGH易检测出高水平扩增。
　　 3.Notch信号通路中的主要成分Notch1,Notch2及Jagged-1在SPN中呈高表达,Notch3,Notch4弱表达或不表达,提示Notch信号通路与SPN的发生发展有密切关系。免疫组化法检测Notch1,Jagged-1有助于我们在日常病理论断中将胰腺实性假乳头状肿瘤与胰腺神经内分泌肿瘤鉴别开来。