柠檬酸转运子和果胶甲酯酶在植物耐铝中的作用

摘要

铝毒是限制酸性土壤上农作物生产的最主要的影响因子，植物的耐铝机制包括外部排斥和内部耐受，其中有机酸的分泌是植物重要的外部排斥机理，也是研究的热点。位于质膜上的有机酸转运子介导植物有机酸的分泌，是有机酸分泌的关键步骤。目前克隆到的有机酸转运子并不多，而且尽管有机酸分泌具有明显的Al诱导特征，但迄今还没有发现完全被铝诱导表达的有机酸转运子。实验室前期研究发现，Al胁迫可诱导饭豆根尖柠檬酸的分泌，且其分泌起始与施加Al胁迫之间有一个明显的滞后期。本研究通过同源克隆手段从饭豆中克隆得到了该柠檬酸转运子，并对其表达和功能进行了研究。另一方面，尽管有机酸的分泌是植物重要的耐铝机理，但不能解释水稻的铝耐性，本研究还以水稻为材料研究了果胶甲酯酶基因家族与铝诱导的根伸长受抑制间的关系。主要结果如下：
　　 1.从头合成的柠檬酸转运子VuMATE在饭豆铝耐性中的作用
　　 饭豆(Vigna umbellata)根系在铝胁迫下可专一性的分泌柠檬酸，并且分泌被延迟了数小时。本研究采用同源克隆和RACE技术从饭豆根尖中分离了一个从头合成(新合成)的柠檬酸转运子基因，由于其属于MATE基因家族的成员，将其命名为VuMATE。VuMATE编码一个565个氨基酸的蛋白质。
　　 VuMATE与已知的柠檬酸转运子具有高度的序列相似性，都包含12个跨膜结构域，在跨膜域2和3之间都有一个位于细胞质中的环状结构，此结构也包含一段保守的氨基酸序列，推测其在柠檬酸转运方面具有重要作用。多序列比对显示，VuMATE与白羽扇豆的LaMATE亲缘关系最近。
　　 RT-PCR分析表明VuMATE在铝处理前没有表达，是第一个完全被铝诱导表达的有机酸转运子基因。VuMATE的表达部位仅限定在0-1cm根尖(铝毒的靶位)，在1-2cm的根成熟区和叶片中都不表达。VuMATE的表达量随着Al处理浓度和处理时间的增加而增加，这与饭豆铝胁迫下根系柠檬酸的分泌模式相一致。VuMATE的表达不受二价金属Cd和Cu的诱导，三价金属La可以诱导VuMATE的表达，但同时加入Al会使表达量进一步提高。亚细胞定位显示VuMATE是一个膜蛋白。
　　 将VuMATE异源表达于爪蟾卵母细胞中的功能分析表明，VuMATE可以介导显著的跨越质膜的内向电流，内向电流的强度依赖于细胞外的H+离子(也可能是Na+)。注射14C标记的柠檬酸发现，VuMATE可以直接介导14C柠檬酸的转运，其转运能力也依赖于细胞外H+。通过转基因的方法在番茄中过表达VuMATE赋予了番茄分泌柠檬酸的能力，提高了番茄对铝的耐受性。
　　 所有这些结果说明VuMATE是饭豆中负责柠檬酸分泌的柠檬酸转运子。通过比较饭豆柠檬酸转运子与其它已知柠檬酸转运子的异同，发现了饭豆柠檬酸转运子具有不同于其它柠檬酸转运子的特点。
　　 2.水稻果胶甲酯酶基因与铝诱导的根伸长抑制相关
　　 水稻是小粒谷类中最耐铝的物种，但有机酸的分泌不能解释其强耐铝性，有研究表明铝主要和细胞壁果胶的负电荷结合，而果胶的负电荷的产生与果胶甲酯酶密切相关。为此，通过对水稻果胶甲酯酶基因家族的表达分析探讨了其与铝诱导根伸长抑制的关系。
　　 从DFCI数据库中下载了水稻果胶甲酯酶基因家族的35个成员，其cDNA序列的GC含量很高，每个成员具有不同的基因结构，所编码的蛋白质分为两组(一组只有PME结构域，一组在PME结构域前还有PMEI结构域)，系统发生关系显示水稻果胶甲酯酶可以分为5类。
　　 当用25μMAl处理铝敏感水稻品种浙辐802(“Zhefu802”)3h，根伸长被抑制了40％，根尖细胞壁的PME活性提升了20％。这时，35个PME基因的表达变化分为4组：A组不表达，B组上调表达，C组下调表达，D组表达量不变。由于B组上调表达的8个PME基因与其酶活变化一致，初步认为这8个基因与铝诱导的根伸长抑制相关。
　　 进一步在铝耐性水稻品种日本晴(“Nipponbare”)中验证了筛选出的8个基因与铝胁迫的关系。结果表明：25μMAl处理3h不影响日本晴根伸长，此时，这8个基因的表达也不受影响；但当将Al处理浓度提高到50μMAl时，日本晴的根伸长受抑制也达到40％，此时，除了2个不表达的基因外，其它6个基因的表达都明显上调。由此，进一步证明了这8个基因与铝诱导的根伸长抑制相关。8个基因对其它金属胁迫的响应不同于铝胁迫，暗示着不同的PME基因对不同的金属胁迫做出响应。
　　 综上所述，从水稻果胶甲酯酶基因家族中筛选出了8个与铝诱导的根伸长抑制相关的基因，为从分子水平上研究细胞壁在抗铝胁迫中的作用提供了切入点。