龙葵碱诱导的反应性氧自由基抑制肝癌细胞生长的机制研究

摘要

目的：
　　 以龙葵碱作为一种抑制肿瘤生长的药物，对肝癌细胞体外作用，通过运用相应的ROS(反应性氧自由基)探针检测肝癌细胞内ROS含量，WesternBlot方法检测凋亡和增殖相关蛋白的表达，观察龙葵碱促进肝癌细胞产生ROS，尤其是H2O2和OH-，并导致肿瘤细胞凋亡的生物学过程，阐明龙葵碱诱导肝癌细胞凋亡的分子生物学机制。
　　 方法：
　　 运用各种不同细胞定位的ROS探针，采用流式细胞术检测荧光值，检测肝癌细胞内ROS的含量，WesternBlot检测凋亡相关蛋白(ASK1、TBP-2)和增殖相关蛋白(TRX2)的含量和活性，并通过倒置显微镜观察龙葵碱作用后肝癌细胞的形态学改变，行研究组和对照组计数比较。
　　 结果：
　　 ROS探针DCFDA和DHR123检测到了龙葵碱预处理之后的肝癌细胞胞浆和线粒体中均存在丰富的ROS(包括OH-，H2O2)，与空白对照相比均有显著性差异(p<0.05)；而O-2特异性的探针DHE和MITSOX，检测龙葵碱预处理之后产生的ROS(即O-2)，与空白对照相比均无显著性差异(p>0.05)；WesternBlot实验结果发现，龙葵碱上调了凋亡相关蛋白ASK1、TBP-2的表达和活性，而抑制了增殖相关蛋白TRX2的表达；计数实验发现，龙葵碱显著抑制肝癌细胞的生长，随着龙葵碱浓度增加和作用时间延长，肝癌细胞变圆、皱缩、漂浮并破碎，死亡细胞逐渐增加，存活细胞数量明显减少。
　　 结论：
　　 (1)龙葵碱诱导HepG2细胞产生ROS，主要是OH-，H2O2，通过线粒体和非线粒体途径，释放ROS后损伤肿瘤细胞。
　　 (2)龙葵碱激活HepG2细胞内凋亡相关蛋白ASK1、TBP-2，抑制增殖相关蛋白TRX2，最终诱导肿瘤细胞凋亡。