耐辐射球菌抗氧化相关酶的鉴定、分离及类胡萝卜素诱导合成的研究

摘要

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是地球上最耐辐射的生物之一，对各种极端压力具有超强的抗性，成为研究极端环境生物适应机理的模式生物之一。D.radiodurans所具有的超强抗氧化特性对其极端抗性起重要作用，而抗氧化相关酶及其催化合成的产物在保健食品、医药等人类健康相关领域具有广阔的应用前景。本实验室之前开展的研究证明D.radiodurans体内合成的类胡萝卜素Deinoxanthin具有超强的抗氧化能力，并且已经鉴定了该类胡萝卜素合成途径的多个关键基因（酶）。已有文献根据同源序列分析，推断D.radiodurans体内存在编码催化合成类胡萝卜素关键前体的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）的可能同源基因CrtE，但相关的实验研究工作包括功能鉴定和酶的分离等一直没有展开。
　　 本论文通过生物信息学分析和分子生物学手段鉴定D.radiodurans体内CrtE基因编码GGPPS。通过序列分析，D.radiodurans体内可能存在2个编码GGPPS相关的基因dr1395和dr0932;从进化亲缘关系上看，dr1395与已经鉴定的T.thermophilus的GGPPS基因P74906_THETH更接近。进一步通过构建突变株、补偿突变株、表达质粒以及与pRK-BI共转化大肠杆菌的类胡萝卜素产物HPLC分析等过程和方法，鉴定了D.radiodurans CrtE基因具有编码GGPPS的功能。进一步，利用新型金属螯合晶胶层析技术，从带His-tag的CrtE表达菌株破胞液中直接分离获得高纯度的GGPPS。一步分离所得的GGPPS纯度达91.4％。对所用的金属螯合晶胶，即Cu2+-IDA-晶胶，在用于分离GGPPS之前进行了结合实验和毛细管模型的性能表征，模型分析结果与实验数据吻合良好，说明该模型适用于相关材料的性能表征。
　　 类胡萝卜素和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是D.radiodurans体内的2种主要抗氧化物质。由于它们具有广阔的市场应用前景，本论文还就如何高效低成本获得这些产物的进行了研究。对于类胡萝卜素，主要考察了光照和金属离子这2类因素对其诱导合成的影响。发现较低剂量的光照可以有效诱导类胡萝卜素的高效合成，在光强度100-150μmol·m-2·S-1下，0.5 hr的光照和2hr的诱导后培养对色素合成较为有利。而过高的光照可能会起抑制。金属离子Fe3+、Zn2+和Cu2+对类胡萝卜素的合成具有诱导作用，而Fe2+和Mn2+对类胡萝卜素的合成具有抑制作用。一般情况下，D.radiodurans体内主要存在Mn-SOD，本论文通过添加Mn2+诱导Mn-SOD的大量合成，并尝试利用通过金属螯合晶胶分离技术高效获得较高纯度的Mn-SOD。
　　 本论文在鉴定D.radiodurans类胡萝卜素合成关键基因CrtE的基础上，利用金属螯合晶胶层析技术高效分离其表达蛋白GGPPS，并研究了光照和金属离子对类胡萝卜素的诱导合成作用。此外，进行了利用金属螯合晶胶直接分离Mn2+诱导的D.radiodurans Mn-SOD的初步研究。

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致谢

摘要

1 文献综述

1．1 耐辐射球菌的研究进展

1．1．1 耐辐射球菌细胞的生理特征

1．1．2 耐辐射球菌属的分类及系统进化

1．1．3 耐辐射球菌基因组结构信息

1．1．4 耐辐射球菌的极端抗辐射机制

1．2 极端微生物Deinococcus-Thermus类胡萝卜素生物合成途径的研究进展

1．2．1 类胡萝卜素

1．2．2 类胡萝卜素的功能

1．2．3 Deinococcus-Thermus菌的类胡萝卜素

1．2．4 类胡萝卜素合成基因及相关合成途径

1．2．5 类胡萝卜素在Deinococcus-Thermus菌中的作用

1．3 类胡萝卜素的诱导合成

1．3．1 光照对类胡萝卜素的诱导合成

1．3．2 金属离子对类胡萝卜素的诱导合成

1．4 晶胶分离技术研究进展

1．4．1 常规连续整体分离介质

1．4．2 晶胶介质

1．4．3 晶胶层析技术现状分析

2 耐辐射球菌类胡萝卜素合成关键酶CrtE的鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌株与培养条件

2．2．2 序列和系统进化分析

2．2．3 dr1395基因敲除突变体的构建

2．2．4 补偿质粒和菌株的构建

2．2．5 表达质粒的构建

2．2．6 DR1395的氨基酸定向突变

2．2．7 类胡萝卜素的提取和分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 D.radiodurans异戊烯转移酶序列分析

2．3．2 pET-95或pET-32表达载体转化E.coli及色素分析

2．3．3 dr1395和dr0932基因敲除突变体

2．3．4 补偿质粒和菌株

2．3．5 DR1395保守区氨基酸的定向突变

2．4 结论

3 金属螯合晶胶分离E.coil中表达的D.radiodurans GGPPS

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试剂

3．2．2 菌种及生长条件

3．2．3 D.radiodurana重组表达GGPPS的构建及培养

3．2．4 Cu2+-IDA晶胶的制备

3．2．5 Cu2+-IDA晶胶的性能表征

3．2．6 用晶胶柱分离GGPPS

3．2．7 蛋白纯度分析

3．3 结果和讨论

3．3．1 Cu2+-IDA晶胶的性质

3．3．2 GGPPS的分离

3．4 结论

4 光照和金属离子对耐辐射球菌中类胡萝卜素的诱导合成

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌种、试剂和实验设备

4．2．2 光照对耐辐射球菌类胡萝卜素的诱导合成

4．2．3 金属离子对耐辐射球菌类胡萝卜素的诱导合成

4．2．4 类胡萝卜素Deinoxanthin的提取和含量的分析

4．2．5 生长曲线的测定

4．3 结果与讨论

4．3．1 光照对耐辐射球菌生长及类胡萝卜素的诱导合成

4．3．2 金属离子诱导类胡萝卜素合成的研究

4．4 结论

5 耐辐射球菌Mn-SOD的晶胶介质层析分离

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 菌种及培养条件

5．2．2 晶胶基质的制备

5．2．3 晶胶基质的性能测试

5．2．4 过渡金属离子的固载

5．2．5 细胞提取物的制备

5．2．6 SOD活性分析

5．2．7 金属螯合亲和层析从耐辐射球菌粗酶液中分离Mn-SOD

5．3 结果与讨论

5．3．1 金属螯合亲和晶胶介质的性能

5．3．2 金属螯合柱用于分离Mn-SOD

5．4 结论

6 总结与展望

参考文献

作者简历