蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香烟诱导的肺部炎症反应中的调节作用

摘要

研究背景和研究目的：吸烟是慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的主要致病因素之一。香烟含有大量的氧化物质，这些氧化物质能激活蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(proteintyrosinephosphataseShp2)活性。Shp2是一种由PTPNⅡ基因编码的蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2个SH结构域，其作为细胞因子、生长因子及其他胞外刺激因素的下游信号分子广泛地表达于机体各种组织和细胞中，参与细胞增殖、分化、死亡等诸多细胞生命活动。近年来的研究发现PTPNⅡ突变将会导致青少年白血病、Noonan综合症，LEOPARD综合症等疾病。而Shp2与香烟烟雾所引起的肺损伤之间关系的研究无论是整体上还是离体上均未见相关的报道。因此本课题主要研究Shp2在吸烟引起的肺炎症反应中的调节作用和作用机制。
　　 方法：离体实验用香烟提取物CSE刺激肺上皮细胞NCI-H292细胞，诱导上皮细胞白介素-8(IL-8)基因表达和蛋白释放上升；采用Shp2抑制剂PHPS1预处理或用siRNA干扰特异性敲出Shp2，研究Shp2在CSE诱导的IL-8表达和释放中的调节作用。整体实验采用野生C57BL/6小鼠以及肺上皮细胞Shp2特异性基因敲除小鼠连续4天被动吸烟诱导肺部炎症反应；计算肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数和淋巴细胞数；肺组织匀浆后用Real-timeRCR方法测定肺组织中IL-8和Shp2基因表达，以及用Westernblotting方法测定蛋白的表达。采用免疫组化方法检测人体气道粘膜和小鼠肺组织的Shp2表达。
　　 结果：(1)吸烟有道肺部炎症：在离体实验中，香烟提取物(CSE)刺激肺上皮细胞NCI-H292，能引起细胞毒反应包括促进和抑制细胞生长，同时能诱导一系列趋化因子和炎症因子基因表达，其中IL-8基因表达最为显著，CSE能浓度和时间依赖性促进肺上皮细胞IL-8基因表达和蛋白分泌。整体动物吸烟模型中，我们同样发现吸烟能促进肺部IL-8释放和炎症细胞特别是巨噬细胞和中性粒细胞的聚集。
　　 (2)吸烟诱导肺组织Shp2高表达和磷酸化：在离体试验中，CSE呈浓度依赖性诱导肺上皮细胞Shp2基因表达以及促进Shp2磷酸化表达。人体样本Shp2免疫组化实验表明，与非吸烟者相比吸烟者肺部Shp2水平显著升高；小鼠肺组织免疫组化实验也表明吸烟能诱导肺部Shp2水平的上升。
　　 (3)Shp2特异性抑制剂减轻吸烟诱导的肺部炎症：离体细胞实验发现，Shp2特异性抑制剂PHPS1能有效抑制由CSE诱导的NCI-H292细胞IL-8基因表达和蛋白分泌；整体动物实验显示，PHPS1能明显降低吸烟小鼠肺部IL-8分泌和炎症细胞聚集和浸润。这些结果表明，Shp2可能参与吸烟诱导的肺IL-8表达和炎症反应。(4)Shp2基因沉默或shp2敲除减轻吸烟诱导的肺部炎症：离体实验表明，肺上皮细胞Shp2基因沉默后能显著抑制CSE诱导的IL-8蛋白分泌；Shp2基因敲除小鼠研究Shp2在吸烟诱导的肺部炎症反应中的作用发现，与正常小鼠相比，肺特异性Shp2敲除小鼠肺部IL-8含量以及炎症细胞聚集和浸润情况没有明显变化，但是经过连续四天吸烟后，肺部Shp2敲除小鼠肺部IL-8含量以及炎症细胞聚集和浸润明显比正常吸烟小鼠减轻。这些结果更进一步确立了Shp2在吸烟诱导的肺部炎症反应中的作用。
　　 (5)Shp2通过MAPK信号通路影响吸烟诱导的肺部炎症：离体实验中，CSE能浓度依赖性地诱导肺上皮细胞EGFR，Gab1和Shp2形成复合物。Erk1/2抑制剂U0126能显著抑制CSE诱导的肺上皮细胞IL-8释放；CSE能浓度和时间依赖性促进磷酸化Erk1/2表达，PHPS1能显著降低由CSE诱导的肺上皮细胞Erk1/2磷酸化；在动物实验中PHPS1特异性抑制小鼠Shp2酶活性或者是小鼠肺上皮细胞特异性敲出后能有效抑制由吸烟诱导的Erk1/2磷酸化。这些结果表明PHPS1通过MAPK信号通路影响CSE诱导的肺上皮细胞IL-8表达。
　　 结论：上述实验结果表明Shp2在吸烟诱导的肺部炎症反应中起关键的作用。Shp2可能是治疗吸烟引起的肺部炎症疾病如COPD的潜在靶点。