金雀异黄酮诱导胃癌细胞周期阻滞和PCDH17基因表达及其启动子区域云甲基化的研究宫内发育迟缓对小鼠肝IGF-1基因表达及表现遗传特征的影响

摘要

研究背景：胃癌是世界第二大常见肿瘤，其发病机理尚不清楚。由于化疗治疗具有较多的副作用，胃癌的治疗寻求更有效的药物具有重要的临床意义。
　　 肿瘤的发生、发展由多基因遗传和表遗传相互参与，共同作用的结果。一些肿瘤抑制基因启动子区域CpG岛的甲基化而使该基因沉默是肿瘤发生的表观遗传调控的一个主要机制。
　　 PCDH17基因是钙粘蛋白超家族的一员，但是其功能尚不清楚。许多PCDH家族的基因，包括PCDH8，PCDH10和PCDH20在各种肿瘤如乳腺癌，鼻咽癌，宫颈癌和肺癌中，均有报道基因沉默的发生，提示了这些基因可能行使肿瘤抑制基因的功能。目前对PCDH17基因的功能罕见报道，由于其与PCDH8，PCDH10等基因同属于Pcdhδ2的亚群，我们推断该基因为胃癌的一个潜在的肿瘤抑制基因。由于PCDH17基因的启动子区域罕有TATA金，并且分散存在许多的CpG岛，提示该基因是一个DNA甲基化致基因沉默的易感基因。
　　 表观遗传的改变能够被药物所逆转，如5-Aza-Cdr能够在甲基化位点形成共价复合物从而去甲基化。然而，该药物由于不稳定且毒性较高，使得其临床应用受到一定的限制。最近，一种大豆提取成分--金雀异黄酮引起了医疗学界的广泛关注。有报道金雀异黄酮能够上调多种肿瘤抑制基因的的表达，而该药物是否能通过PCDH17基因启动子区域的去甲基化机制调控胃癌细胞PCDH17基因表达尚不清楚。
　　 第一部分，研究目的：研究金雀异黄酮的对胃癌细胞的毒性与抗肿瘤的功效，揭示PCDH17基因mRNA的表达水平与胃癌的相关性，并探究金雀异黄酮对胃癌细胞PCDH17基因表达的影响；研究PCDH17基因启动子区域甲基化状态与基因表达的相关性，以及金雀异黄酮对胃癌细胞PCDH17基因启动子区域的甲基化状态的影响。本实验对于探讨胃癌进展过程中PCDH17基因行使的功能，阐明该基因在胃癌发生发展中的表观遗传调控机理，具有重要意义；同时也为寻求新的胃癌治疗药物提供实验依据。
　　 研究方法：
　　 1、金雀异黄酮对胃癌细胞株及胃正常细胞株生长抑制和细胞周期的影响
　　 将胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1使用1640培养液，10％的胎牛血清，5％CO2，于37℃培养箱中培养。分别使用0、10、25和50uM的金雀异黄酮与0、2.5、5和10uM的5-AZA-Cdr处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1，使用CellCountingKit-8试剂盒检测金雀异黄酮对两种细胞的增殖能力的影响，并与5-Aza-Cdr的作用相比较。采用流式细胞术，研究金雀异黄酮对肿瘤细胞和正常细胞细胞周期和凋亡的影响。
　　 2、胃癌PCDH17基因表达水平的检测和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17基因mRNA表达的研究
　　 选取新鲜的的临床胃癌及自身对应的正常胃组织，要求患者术前未经任何放、化疗。使用Trizol抽提RNA，使用High-Capacityc DNA Reverse Transcription Kit合成cDNA。使用Primer Express software软件设计PCDH17基因RT-PCR引物。GAPDH作为内参照。使用7900快速实时定量PCR系统进行Real-time RT PCR检测不同胃癌组织及正常对照组织中PCDH17mRNA表达水平的差异。
　　 分别使用0、10.0、25.0和50.0uM的金雀异黄酮与0、2.5、5.0和10.0uM的5-AZA-Cdr进行处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1，72h后弃去培养液，加入1mlTrizol抽提RNA，随后用同样的方法检测检测金雀异黄酮处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1中PCDH17mRNA表达水平的改变，并与5-Aza-Cdr处理作用相比较。
　　 3、胃癌组织及配对胃正常组织PCDH17基因启动子区域的甲基化谱研究和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17基因启动子区域去甲基化的研究
　　 用TiangenDNA抽提试剂盒，提取胃癌组织基因组DNA和其正常对照组织的基因组DNA。使用EZ DNA Methylation-Gold Kit将500ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。设计特异性引物并采用亚硫酸氢盐PCR扩增PCDH17基因第一外显子上游的1000bp的启动子区域。将PCR产物连接至载体psc-A，转入感受态细胞。每个样本挑取15个克隆并PCR扩增确认，挑选10个克隆细菌培养提取质粒并测序。统计分析测序结果中各CpG位点的甲基化频率。揭示PCDH17基因启动子区域甲基化对于mRNA表达的影响和胃癌发生的相关性。
　　 使用25uM的金雀异黄酮与5uM的5-AZA-Cdr分别处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1，72h后收集细胞。用同样的方法检测金雀异黄酮药物处理前后PCDH17基因启动子区域CpG位点甲基化谱的改变，并与5-Aza-Cdr进行比较。揭示金雀异黄酮诱导PCDH17基因mRNA表达的表观遗传机制。
　　 研究结果：
　　 1、金雀异黄酮对胃癌细胞株及胃正常细胞株生长抑制和细胞周期的影响
　　 AGS细胞经25μM金雀异黄酮处理72h后，有明显的G2-M期阻滞，而经5μM的5-Aza-Cdr处理后，无细胞周期改变但有明显的细胞凋亡发生。而两种药物均对Ges-1的细胞周期和凋亡无明显改变。CCK-8细胞增殖实验表明，金雀异黄酮和5-Aza-Cdr均对胃癌细胞株AGS具有显著的抑增殖作用，且呈时间和剂量的依赖性。两种药物对AGS的抑增殖作用均较Ges-1更显著。
　　 2、胃癌PCDH17mRNA水平的检测和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17mRNA表达的研究胃癌细胞株AGS与胃正常细胞株Ges-1的PCDH17mRNA表达水平无显著差异。胃组织PCDH17mRNA水平存在广泛的个体差异性。35例胃癌组织中，PCDH17mRNA水平相对自身正常对照组织显著下降的有29例，比率高达82.86％。并且高-中分化组和中低分化组中下降的比例显著高于低分化组。TNMⅠ+Ⅱ期显著高于Ⅲ+Ⅳ期。
　　 金雀异黄酮和5-Aza-Cdr均显著上调胃癌细胞株AGS的PCDH17mRNA的表达，其中25μM金雀异黄酮处理组AGS的PCDH17mRNA水平增加至未处理时的15-16倍，5μM的5-Aza-Cdr处理组上调至未处理时的8-9倍。两种药物处理前后，胃正常细胞株Ges-1的PCDH17mRNA表达水平无明显变化。
　　 3、胃癌组织及配对胃正常组织PCDH17基因启动子区域的甲基化谱研究和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17基因启动子区域去甲基化的研究
　　 胃组织PCDH17基因启动子区域甲基化谱存在个体差异。与自身正常对照相比，胃癌组织PCDH17基因启动子区域个别CpG位点存在高甲基化，如1号样本的-870位点，-731位点和-458位点。此外，不同个体中易感性CpG位点不同。
　　 金雀异黄酮和5-Aza-Cdr均显著改变了胃癌细胞株AGS的PCDH17基因启动子区域甲基化谱，但受影响的CpG位点不同。而金雀异黄酮处理组(25μM，72hrs)在PCDH17基因启动子-678位点，-614位点，-458位点，-207位点和-129位点有明显的去甲基化，而5Aza-Cdr处理组(5μM，72hrs)在PCDH17基因启动子-84位点和-74位点有明显的去甲基化。胃正常细胞株Ges-1的两种药物处理组均无明显去甲基化发生。
　　 结论：(1)金雀异黄酮可以抑制胃癌细胞AGS的生长，其抗肿瘤作用是通过G2-M期阻滞来实现的；且该药物对正常细胞Ges-1的抑增殖作用显著弱于AGS，提示该药物对正常细胞毒性相对较弱。(2)PCDH17基因的表达具有广泛的个体差异，但在胃癌组织中表达水平显著低于自身正常对照组织，提示该基因是个潜在的肿瘤抑制基因；且其表达下降在早期胃癌中更为显著，可能作为诊断早期胃癌的一个指标.(3)胃癌组织中PCDH17基因启动子区域CpG岛高甲基化导致基因沉默，与胃癌癌变相关。(4)金雀异黄酮能显著诱导胃癌细胞株AGS细胞PCDH17基因的表达，并且其表达上调机制与该基因启动子区域去甲基化相关。(5)与去甲基化药物5-Aza-Cdr相比，金雀异黄酮具有更为显著的去甲基化功能，并且该药物天然、无毒、稳定，具有潜在的临床应用价值。
　　 上述研究成果，为了解PCDH17基因的功能和胃癌的发生机制，研究金雀异黄酮的抗肿瘤作用的分子机理提供了新的思路，具有理论意义和潜在的临床应用价值。
　　 第二部分，宫内发育迟缓对小鼠肝IGF-1基因表达及表观遗传特征的影响
　　 研究背景：研究表明宫内发育迟缓会引起血浆中IGF-1水平下降。IGF-1基因含有2个独立的启动子、选择性转录的第五外显子，以及3'端多个转录终止位点，能编码多种IGF-1基因转录子，如启动子1启动的转录子P1；启动子2启动的转录子P2；无第五外显子的转录子IGF-1A及含第五外显子的转录子IGF-1B，是一个表观遗传调控基因。肝脏是体内IGF-1的主要合成部位，而宫内发育迟缓对出生后肝组织IGF-1基因各种转录子的表达水平以及IGF-1基因表观遗传特征的影响尚不清楚。
　　 研究目的：我们推测胎盘供血不足导致的宫内发育迟缓将会改变出生时及出生以后肝组织IGF-1基因各转录子的表达水平，并且会改变IGF-1基因的表观遗传特征，包括启动子区域的甲基化水平和组蛋白共价修饰密码。
　　 研究方法：将加载血栓素A2受体激动剂的微渗透泵植入孕13天的母鼠体内，诱导胎盘供血不足，进而导致胎儿宫内发育迟缓。加载0.5％酒精的微渗透泵的孕鼠后代作为正常对照组。采用实时定量逆转录PCR方法检测出生时和三周龄IUGR小鼠IGF-1mRNA表达水平，包括P1转录子，P2转录子，IGF-1A和IGF-1B。亚硫酸氢钠处理测序法检测启动子1和启动子2CpG岛的甲基化。染色质免疫共沉淀联合实时定量PCR法检测IGF-1基因第一外显子、第二外显子、第五外显子、近端3’UTR及远端3'UTR的组蛋白共价修饰密码。
　　 研究结果：
　　 (1)IUGR对小鼠肝组织IGF-1转录子的影响：出生时，IUGR显著降低了新生小鼠肝组织总mRNA水平，其中P1和IGF-1B显著降低。IGF-1A在IUGR雄性新生小鼠中也出现明显下降。三周龄时，IUGR显著降低了雄性小鼠肝IGF-1总mRNA水平，其中P1，P2以及IGF-1A显著降低，而雌性小鼠总mRNA及各转录子水平均无改变。
　　 (2)IUGR对小鼠肝组织IGF-1基因启动子1和启动子2CpG岛甲基化的影响：出生时，IUGR雄性小鼠启动子1-78位点CpG甲基化显著增高；IUGR雌性小鼠启动子1-142位点CpG甲基化显著增高，-110位点和-328位点CpG甲基化显著降低。
　　 三周龄时，IUGR雌性小鼠启动子1-328位点CpG甲基化显著增高，启动子2-347和-93位点的CpG甲基化显著增高。
　　 (3)IUGR对小鼠肝组织IGF-1基因第一外显子、第二外显子、第五外显子、近端3’UTR及远端3’UTR组蛋白共价修饰密码的影响：出生时，IUGR雄性小鼠IGF-1基因第五外显子和3’UTRH3K9乙酰化显著增高；IUGR雌性小鼠IGF-1基因第二、五外显子H3K9三甲基化显著增高；3’UTRH3K9三甲基化显著增高，H3K9乙酰化和及H3K4三甲基化显著降低。
　　 三周龄时，IUGR雄性小鼠IGF-1基因近端3’UTRH3K9三甲基化显著下降，IUGR雌性小鼠IGF-1基因第一外显子H3K4和H3K9三甲基化增高，第五外显子H3K14乙酰化降低，H3K4二甲基化增高；近端3’UTRH3K9三甲基化显著上升，远端3’UTRH3K4三甲基化增高。
　　 结论：(1)IUGR降低了肝IGF-1基因各种转录子的表达水平和表观遗传特征，且IUGR对雄性的影响较雌性显著。(2)启动子DNA的甲基化与组蛋白共价修饰相互作用，组蛋白的不同化学修饰之间又发生协同或者拮抗的相互作用，共同行使IGF-1基因转录的表观遗传调控。(3)IUGR导致的组蛋白修饰密码应年龄的不同而改变，提示了在不同的发育阶段，不同的组蛋白共价修饰复合物受到了影响。