地西他滨对白血病细胞WT1基因表达及启动子区域甲基化水平的调控研究

摘要

目的：研究白血病细胞株U937、K562,白血病患者肿瘤细胞、正常人骨髓单个核细胞给予地西他滨(5-aza-2 deoxycytidine,DAC)前后WT1基因的表达与启动子区域甲基化水平的改变以及两者之间的关系,观察U937细胞株、K562细胞株、正常人骨髓单个核细胞给予地西他滨前后凋亡的改变。探讨通过地西他滨的去甲基化作用来激活异基因造血干细胞移植后表达沉默或低下的WT1基因,从而刺激供体来源的WT1特异性CTL增加,增强移植物抗肿瘤效应的可能性。
　　方法：1.Real-time PCR法检测两种白血病细胞株U937、K562以及正常人骨髓单个核细胞的WT1基因mRNA表达量并比较区别;2.亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测两种白血病细胞株及正常人骨髓单个核细胞 WT1基因启动子区域的甲基化状况并比较区别;3.流式细胞仪测定经过不同浓度的地西他滨处理后两种白血病细胞株以及正常人骨髓单个核细胞的凋亡率;4.给予地西他滨去甲基化处理后再次检测两种白血病细胞株WT1基因mRNA表达和启动子区域甲基化状况并比较区别;5.采集临床使用地西他滨抗肿瘤疗法的患者使用地西他滨前后的外周血标本,测定其WT1基因mRNA表达和启动子区域甲基化状况的变化。
　　结果:1. U937细胞株WT1 mRNA的相对表达量多次测定均为阴性;K562细胞株WT1 mRNA拷贝数为(5015±450)copies/10000copies;正常人骨髓单个核细胞的WT1 mRNA拷贝数为(13±10)copies/10000copies;2. U937细胞WT1启动子区域甲基化率(89±5.9)％,K562细胞WT1启动子区域甲基化率(4±0.2)%,正常人骨髓单个核细胞WT1启动子区域甲基化率(2±0.1)%;3.地西他滨均可引起U937、K562细胞株的凋亡,具有时间和剂量依赖性;而作用于正常人骨髓单个核细胞后凋亡率较低,并且未体现时间依赖性;4.给予不同剂量地西他滨后U937、K562的WT1mRNA表达量均上升,具有时间剂量依赖性,且U937上升程度较大;给予不同剂量地西他滨后U937的WT1启动子区域甲基化水平下降明显,具有时间剂量依赖性;K562给药前后WT1基因启动子区域甲基化水平无明显变化。5.四例临床患者使用地西他滨后,WT1mRNA表达水平上升,且WT1基因启动子区域甲基化水平有不同幅度下降。
　　结论:1.在白血病细胞株U937、K562中,WT1基因mRNA表达和启动子区域甲基化水平呈负相关,而正常人骨髓单个核细胞上WT1基因表达阴性,且启动子区域低甲基化。2.地西他滨对于白血病细胞株U937、K562促进凋亡,并且促凋亡的效应强于对正常人骨髓单个核细胞促凋亡效应。3.地西他滨对于白血病细胞株U937WT1启动子区域去甲基化作用显著,并有效提高WT1基因mRNA表达量。在临床患者体内也有相似效应。

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引言

材料和方法

实验方法

一、试剂的配置、细胞培养与药物处理

二、流式细胞仪测定细胞凋亡

三、实时定量Real-time PCR

四、BSP检测WT1启动子区域的甲基化状态

三、统计学处理

结果

一、 实时定量RT-PCR检测WT1基因mRNA的表达

二、 流式细胞仪测定给予地西他滨后细胞凋亡情况

三、 BSP法检测WT1基因启动子区域的甲基化状态

讨论

参考文献

综 述·

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