活化CD8+T细胞来源的exosomes通过Fas途径促进肿瘤侵袭及其相关机制的研究

摘要

迄今为止，肿瘤的免疫治疗在临床中效果有限，究其原因，主要在于肿瘤免疫和免疫逃逸机制的复杂性，现在肿瘤复发与逃逸已经成为肿瘤免疫治疗的主要障碍，而肿瘤的远处转移是肿瘤复发、不易根治的最主要原因，因此深入研究肿瘤转移的相关机制，对于探索一种有效的肿瘤治疗方法具有非常重要的科学意义。
　　 肿瘤的侵袭能力指肿瘤细胞破坏基底膜及移行进入结缔组织的能力，肿瘤侵袭能力的强弱最终决定了肿瘤转移的程度。MMP9是基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)中的一种，可以降解基底膜的主要成分-胶原，能够促进肿瘤细胞的侵袭。现在有研究表明，在炎症或者肿瘤发生时，高表达的FasL能够通过活化外周血髓系细胞或者肿瘤细胞的Fas信号，上调这些细胞的MMP9表达，加速它们向周围组织浸润、侵袭。这些结果提示细胞Fas信号的活化与MMP9的表达水平存在着某种重要的关联。
　　 Fas是经典的死亡受体，当Fas配体(Fas ligand，FasL)与Fas结合后，可以介导Fas活化，诱导细胞凋亡，从而维持机体的稳态。但是，在很多情况下，Fas可以引起非凋亡途径，包括促进炎症反应、神经突生长、肝组织再生、细胞增生及分化、血管再生、纤维化、细胞周期进展、细胞迁移等。虽然几乎所有的肿瘤细胞都表达Fas受体，但很大一部分肿瘤细胞中Fas信号的活化，不但不引起肿瘤细胞的凋亡，反而促进肿瘤的生长与转移。
　　 活化的肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)是清除肿瘤细胞的最重要的效应细胞，活化的CTL能够高表达FasL。肿瘤发生时，虽然机体免疫被激发，肿瘤局部有活化CD8+T淋巴细胞(CTLs)聚集，但是其杀伤肿瘤的作用非常有限。因此，理解肿瘤逃逸和复发的机制可能为促进抗肿瘤T细胞治疗提供重要的思路。现在，肿瘤活化的CTL通过FasL/Fas信号对肿瘤产生了怎样的作用还不清楚。有文献报道活化的T细胞分泌大量表达FasL的具有生物活性的exosomes，这种exosomes能够诱导T细胞和树突状细胞(Dendritic cells，DCs)凋亡，从而发挥免疫抑制功能。
　　 Exosomes是由活细胞分泌的来源于多囊泡体的具有脂质双分子层膜结构的纳米级囊泡，其直径约为50-100nm，密度范围从1.13g/ml到1.19g/ml，可经过多次密度梯度超速离心分离得到。来自不同细胞的exosomes具有生物功能的多样性。现在已经有大量的关于FasL表达的exosomes及其相关的免疫抑制功能的文献报道，但是，这些文献主要关注的是FasL表达的exosomes对T淋巴细胞及DC免疫功能的影响，而有关FasL表达的exosomes是否能够直接参与肿瘤Fas信号的活化，并促进肿瘤的转移，特别是与肿瘤转归密切相关的活化CTL分泌的FasL表达的Exosomes与肿瘤细胞转移是否具有相关性的文献报道很少。我们设计实验，制备了来自活化CTL的FasL阳性exosomes，研究其对肿瘤细胞侵袭的作用及其相关机制，并且证实了这样的exosomes在体内的存在及其生理意义。
　　 首先，我们通过OVA257-264多肽活化OT-I小鼠来源的CD8+T淋巴细胞，提取其分泌的活化CD8+T细胞来源FasL阳性的exosomes(EXO)。将EXO与表达Fas的B16小鼠黑色素瘤细胞或3LL小鼠肺癌细胞共培养，检测B16细胞或3LL细胞的增殖和凋亡情况，结果发现，B16细胞或3LL细胞表现出对EXO诱导凋亡抵抗，而EXO对B16细胞或3LL细胞的生长增殖没有影响。为了进一步观察EXO对于肿瘤细胞的影响，我们进行了体外侵袭实验。EXO可以促进B16小鼠黑色素瘤细胞以及3LL小鼠肺癌细胞的侵袭能力，当EXO用FasL中和抗体处理之后，它们对B16细胞和3LL细胞诱导侵袭能力的作用明显下降，表明EXO通过FasL/Fas信号发挥对肿瘤细胞的侵袭作用。由于MMP9与Fas信号的相关性以及MMP9对细胞侵袭的重要作用，我们检测了EXO作用于B16细胞之后，MMP9的表达变化。Realtime及western blot结果显示，EXO能够通过Fas信号上调B16细胞MMP9的表达，当MMP9的作用被抑制之后，EXO诱导B16细胞侵袭的能力明显下降，证明EXO对B16细胞的侵袭作用是通过Fas信号上调MMP9表达来完成的。
　　 FasL能够活化肿瘤细胞的NF-κB和ERK信号通路，活化的NF-κB、ERK能够增加MMP9的表达。类似的，我们证明活化CD8+T细胞来源FasL阳性的EXO能够活化NF-κB和ERK信号通路，当NF-κB和ERK介导的信号通路被NF-κB抑制剂PDTC、ERK抑制剂U0126阻断后，EXO诱导B16肿瘤细胞上调MMP9以及侵袭的作用被有效的阻断，提示活化的NF-κB和ERK信号通路参与了EXO对B16细胞诱导MMP9表达及侵袭的作用。
　　 在对凋亡抵抗肿瘤细胞Fas信号通路的研究过程中人们发现，凋亡抵抗的肿瘤细胞能够通过上调Fas相关的死亡结构域IL-1β样转换酶抑制蛋白(Cellular FLICE inhibitory proteins，c-FLIP)来抑制经典凋亡通路的活化。活化CD8+T细胞来源FasL阳性的EXO作用于B16细胞5分钟之后，c-FLIPL水平增加，这种高水平可以持续到刺激之后24小时。以前报道c-FLIP能够促进NF-κB和ERK信号活化，而活化的NF-κB能够诱导c-FLIP的表达，并且与MMP9表达有关。所以我们检测了EXO作用B16细胞之后，c-FLIP与NF-κB、ERK信号通路的相互关系以及c-FLIP对MMP9的作用。结果我们证明，c-FLIPL介导了EXO促进B16细胞NF-κB和ERK磷酸化，反过来，NF-κB和ERK信号通路在EXO诱导B16细胞c-FLIPL水平升高中发挥了作用。同时，当B16细胞c-FLIPL的表达被siRNA干扰之后，EXO促进B16细胞上调MMP9及侵袭的能力也下降了，但是并没有逆转EXO对B16细胞的凋亡抵抗作用，表明c-FLIPL可能主要在EXO诱导肿瘤细胞上调MMP9表达及促进肿瘤细胞侵袭中有重要的作用。同时，我们还发现，EXO能够通过NF-κB和ERK信号促进B16细胞的凋亡保护蛋白Bcl-2的表达增加，Bcl-2与EXO凋亡抵抗关系密切。
　　 综合上述体外实验的结果，活化CTL能够分泌表达FasL的exosomes，EXO通过FasL/Fas作用于B16细胞后，c-FLIPL在较长时间内维持一个较高的水平，NF-κB和ERK信号通路被激活，MMP9表达上调，最终促进B16细胞的侵袭能力增加，有利于肿瘤细胞转移。在这个通过EXO上FasL引起的非凋亡途径中，c-FLIPL与NF-κB和ERK信号通路相互促进，Bcl-2表达升高，最终起到引起肿瘤细胞凋亡抵抗，侵袭能力增强的作用。
　　 为了验证体外制备的活化CD8+T细胞来源FasL阳性的EXO在体内对肿瘤侵袭的作用，我们设计了小鼠体内肺转移实验，通过尾静脉将B16肿瘤细胞和EXO共同注射入小鼠体内，14天后，解剖小鼠发现，EXO组B16肿瘤细胞肺转移增强，而EXOcont与对照相比没有明显差别，当FasL中和抗体作用EXO后，肺转移现象也得到了缓解。表明EXO通过FasL/Fas通路在体内促进B16肿瘤细胞侵袭。
　　 上述实验中FasL阳性的EXO都是体外培养OT-I小鼠来源的活化的CD8+T淋巴细胞纯化得到的，我们希望在体内可以找到生理存在的来自于CTL的表达FasL的具有促侵袭作用的exosomes。首先，我们通过皮下注射B16肿瘤细胞建立小鼠肿瘤模型，通过免疫荧光技术，证明在荷瘤小鼠的脾脏、淋巴结和肿瘤组织局部存在有CD8、FasL双阳性的细胞，而在对照小鼠中没有发现这样的细胞，确定了这种exosomes起源细胞在荷瘤小鼠中的存在。接着，我们从荷瘤小鼠的淋巴组织及肿瘤组织分离纯化得到exosomes，然后用CD8磁珠分选得到CD8+exosomes。CD8+exosomes体外与B16细胞共培养后，B16细胞的MMP9表达升高，侵袭能力增强。表明体内存在这样一群CD8+FasL+exosomes，能够促进肿瘤的侵袭。同时，我们用3LL肿瘤细胞建立肿瘤模型，验证了这一过程，表明体内这样一群具有肿瘤免疫逃逸作用的CD8+FasL+exosomes可能是一个较为广泛的现象。
　　 综上所述，本课题的研究完整的揭示经由活化CD8+T细胞来源的Exosomes所介导的肿瘤转移的全新机制，从而为肿瘤的治疗提供一种新的靶点与思路。