酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼与吉非替尼的肝脏毒性及其机制研究

摘要

目的：考察小分子酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼与吉非替尼的肝脏毒性,研究两者的肝脏毒性的作用机制,筛选寻找有效的肝脏保护剂,为两药的临床合理运用提供依据。
　　 方法：Sprague-Dawley大鼠灌胃给予Dasatinib,静脉采血检测血清AST、ALT和LDH值,肝组织匀浆,检测谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)值,肝组织固定,切片HE染色做病理学检查,评价Dasatinib的体内肝脏毒性。培养大鼠原代肝细胞,正常人肝细胞L02及Changliver研究Dasatinib对肝细胞的体外毒性机制。紫外吸收连续扫描检测Dasatinib与GSH的测结合能力。MTTassay检测不同浓度Dasatinib对大鼠原代肝细胞,正常人肝细胞L02及Changliver作用48h的IC50值。DAPI染色,DNA凝胶电泳,PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,吖啶橙(AO)染色检测自噬,H2DCFDA染色和JC-1染色结合流式细胞术检分别检测活性氧族(ROS)含量和线粒体膜电位(△ψm)的变化,westernblot法检测Dasatinib诱导的凋亡、自噬以及氧化应激相关蛋白表达量的变化。荧光定量PCR检测HO-1和NQ01的mRNA水平。siRNA基因沉默技术沉默Atg5,JNK和p38的表达,讨论自噬和凋亡的关系,以及MAPK通路与自噬和凋亡的关系。荷人非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤模型评价Gefitinib的体内抗肿瘤活性,同时眼眶采血检测血清AST、ALT和LDH值,肝组织切片。HE染色病理学检查,评价Gefitinib的体内肝脏毒性。L02及Changliver研究Gefitinib对肝细胞的体外毒性机制,MTTassay检测IC50值,流式细胞术检测ROS含量,AO染色检测自噬,siRNA基因沉默技术沉默Atg5,讨论自噬和凋亡的关系,westernblot法检测Gefitinib诱导的凋亡、自噬以及氧化应激相关蛋白表达量的变化。
　　 结果：
　　 1.Dasatinib在体内可弓l起Sprague-Dawley大鼠体重的减轻,血清肝转氨酶AST、ALT和LDH的升高,肝组织内GSH、SOD的降低和MDA的升高,损伤肝脏产生广泛的空泡化,TUNEL染色检测呈现阳性。
　　 2.Dasatinib在体外对大鼠原代肝细胞,正常人肝细胞L02及Changliver有明显的细胞毒性,作用48h后有较低的IC50值分别为21.1μM,12.5μM和15.5μM。
　　 3.DAPI染色显示Dasatinib作用肝细胞后,引起细胞核的固缩、碎裂,形成凋亡小体,DNA凝胶电泳表明,Dasatinib作用肝细胞后致使DNA形成180-200成倍碱基对的断裂,形成典型的DNA梯状条带,westenblot结果显示凋亡通路的效应蛋白cleavedcaspase-3和PARP的切割片段都有相应的表达改变,表明Dasatinib对肝细胞的损伤主要是通过细胞凋亡实现的。
　　 4.37℃GSH与Dasatinib共孵育5h,200-260nm紫外吸收连续扫描显示GSH的吸收峰和Dasatinib的吸收峰发生位移,表明Dasatinib能共价结合部分细胞内重要的还原性物质GSH。
　　 5.H2DCFDA染色显示,Dasatinib能显著升高肝细胞内ROS水平,降低细胞内GSH的含量,形成氧化应激,并激活MAPK通路,致使JNK,p38,ERK发生磷酸化,磷酸化蛋白呈现先增加后下降的变化趋势,N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为典型的自由基清除剂能部分逆转保护Dasatinib引起的氧化应激。与此同时,氧化应激的下游,兼有抗氧化应激应答的转录因子Nrf2被解离释放出来,核转位后促进抗氧化基因HMOX-1和NQ01的mRNA转录水平的上调。
　　 6.JC-1染色显示,Dasatinib作用后导致细胞内线粒体膜电位的下降,线粒体肿胀实验显示,Dasatinib30μM能引起线粒体开放性孔道的开放,释放细胞色素c,级联激活caspase通路,最终引起细胞的凋亡。
　　 7.Dasatinib弓I起肝细胞氧化应激的同时,还能诱导肝细胞的产生内质网应激(ERstress),与之相关的通路上的关键蛋白p-eIF2α,p-PERK,ATF4和CHOP都有相应的变化,ERstress可以级联caspase的激活并导致肝细胞的凋亡。
　　 8.通过对人源性肝细胞L02和Changliver的进一步研究发现,Dasatinib产生氧化应激诱导凋亡的同时,引起肝细胞发生自噬,并且这种自噬和凋亡是相互伴随的,是一种保护性的自噬,预孵育3-甲基腺嘌呤(3-MA)或沉默Atg5基因能够减弱自噬而加重凋亡。
　　 9.Dasatinib激活的MAPK通路中,JNK与细胞的凋亡发生有关,p38与细胞的自噬有关。沉默JNK基因,Dasatinib诱导的自噬不发生变化而凋亡增加;沉默p38基因,Dasatinib诱导的自噬减弱而凋亡增加。
　　 10.典型的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能减弱Dasatinib引起L02和Changliver肝细胞ROS水平的升高。降低Dasatinib诱导的LC3,cleavedcaspase-3和PARP的表达,减弱自噬和凋亡,保护Dasatinib诱导的肝细胞毒性。
　　 11.Gefitinib200mg/kg能有效地抑制裸鼠荷非小细胞肺癌A549瘤的生长,在产生抑瘤药效的同时,发生了肝脏毒性,伴随血清ALT、AST和LDH的升高和肝组织切片的病理学改变。
　　 12.Gefitinib作用L02和changliver肝细胞48h后的IC50值分别为24.1μM和31.9μM.Gefitinib能弓I起L02和ChangliverROS的水平升高,激活MAPK通路,磷酸化激活的JNK,p38和ERK都呈现出增加的趋势。
　　 13.Gefitinib在低浓度的情况下引起L02和Changliver的强烈自噬,在高浓度的情况下引起凋亡,自噬和凋亡呈现出先后的关联顺序,并且这种自噬也是保护性的。
　　 结论：酪氨酸激酶抑制剂Dasatinib与Gefitinib在体内外都显示出明显的肝毒性,两者能够消耗肝细胞内的GSH,升高ROS水平,形成氧化应激,级联MAPK通路的激活,损伤线粒体的功能,最终导致肝细胞的凋亡发生,与此同时,Dasatinib与Gefitinib能诱导肝细胞产生保护性的自噬。