循环游离核酸在结直肠癌中的临床应用研究

摘要

EGFR单抗等靶向药物的应用显著改善转移性结直肠癌的生存，但其显著的疗效差异与毒性不良反应，及其昂贵的治疗费用促使研究者不断探索其药物疗效的生物预测因子，其中KRAS、BRAF基因突变状态备受关注。目前，对于肿瘤患者的KRAS和BRAF基因突变分析主要基于肿瘤原发灶组织标本的检测结果。然而研究表明，基因的突变状态随着治疗的进行实时变化，肿瘤的异质性决定原发灶肿瘤组织检测阴性并不能完全排除转移灶突变阳性的可能。同时，晚期患者不管是原发灶还是转移灶获取组织标本进行基因突变分析临床实践困难，受到伦理限制。
　　早在60年前循环游离核酸(cfDNA)已被关注，研究表明肿瘤患者外周血中的cfDNA较健康体检者明显增高，其中具有某些与原发肿瘤相同的遗传学改变，可以替代组织检测肿瘤特异性突变等基因异常；定量分析cfDNA水平亦具有肿瘤早期诊断和预后判断的价值。然而由于受到提取方法、定量技术及下游检测技术等多方面因素的限制，直到最近十年肿瘤cfDNA研究才逐渐进入临床应用。
　　本研究优化cfDNA提取与定量分析技术，自主建立高灵敏度的锁核酸修饰扩增受阻突变检测体系即ARMS-qPCR(LNA)技术用于血浆cfDNA KRAS和BRAF突变检测。利用以上技术，拟开展以下两部分研究。
　　第一部分结直肠癌循环游离核酸定量分析的诊断及预后判断价值
　　目的：探讨初次治疗前cfDNA水平在结直肠癌早期诊断及预后判断中的临床应用价值。
　　方法：入组178例结直肠癌患者及56例健康体检者，收集其临床病理信息。富集并精确定量受试者血浆cfDNA水平，率先进行受试者工作曲线(ROC曲线)TNM亚组分析，评价cfDNA水平的早期诊断价值。对Ⅳ期结直肠癌患者进行随访，分析cfDNA水平与患者生存之间的相关性。
　　结果：血浆cfDNA水平与肿瘤分化程度、TNM分期密切相关。ROC曲线分析显示血浆cfDNA水平对早期结直肠癌患者(Ⅰ-Ⅲ期患者)无诊断价值。生存分析显示血浆cfDNA浓度与疾病总生存期(OS)相关。
　　结论：血浆cfDNA水平缺乏早期诊断价值；初次治疗时的血浆cfDNA浓度是有效的预后指标。
　　第二部分结直肠癌血浆循环游离核酸KRAS/BRAF突变检测
　　目的：评价血浆cfDNA替代组织检测KRAS/BRAF突变的可行性。
　　方法：自主建立KRAS/BRAFARMS-qPCR(LNA)突变检测技术，独创性地利用肿瘤原发灶内异质性分析验证其是否可用于低比例突变检测。入组165例结直肠癌患者肿瘤组织及其配对血浆标本，sanger测序法及ARMS-qPCR(LNA)法分别检测其中的KRAS/BRAF突变，分析其符合率。
　　结果：肿瘤原发灶内的异质性分析显示高灵敏度的ARMS-qPCR(LNA)技术可以避免因肿瘤异质性导致的假阳性；血浆与组织突变检测符合率与TNM分期及cfDNA水平密切相关。Ⅳ期患者血浆cfDNA突变检测与组织阳性符合率高达84％(21/25)。
　　结论：血浆cfDNA可以取代肿瘤组织检测KRAS/BRAF突变，但仅限于晚期转移性患者临床价值高。