脆性X综合征的筛查、诊断和社会适应能力及Fmr1基因敲除小鼠的神经机制研究

摘要

脆性X综合征(Fragile X mental retardation Syndrome，FXS)是一种常见的遗传性精神发育迟滞性疾病，其发病率高达1/4000。绝大多数的FXS是由于X染色体FMR1(fragile X mental retardation-1)基因(CGG)n重复序列过度扩展导致基因甲基化而引起的。男性患者临床表现较女性患者严重，主要表现为中、重度的精神发育迟滞，伴特殊面容，如长脸、大或招风耳，青春期以后出现大睾丸，许多患者还表现为多动、冲动、焦虑、社交退缩、刻板语言等孤独症样行为。早期发现、早期治疗和干预，可以显著改善患儿预后，并为家系成员提供遗传咨询，避免家族中再次出现同样患者，具有不可估量的社会效益和经济效益。
　　本研究应用双重实时荧光定量PCR技术，即普通实时荧光定量PCR联合甲基化敏感性限制性内切酶定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-basedquantitative PCR，MSRE-QPCR)技术，进行FXS患者FMR1基因(CGG)n序列和CpG岛甲基化程度的定量检测，结果发现，该技术对男性患者的诊断效率极高，既可以诊断全突变男性，也可以辨别男性全突变/前突变嵌合体，与Southern blot相当；对女性全突变患者的甲基化分辨率也较高，可以作出诊断，但对于女性全突变和全突变/前突变嵌合体的分辨率欠佳。该技术自动化程度高，重复性好，快速经济，需要DNA量少，可以进行高通量的大样本检测，因此，我们建议可以将其推广用于脆性X综合征(尤其是男性患者)的分子生物学诊断和人群筛查。
　　目前，关于我国脆性x综合征儿童临床特征和社会适应能力的研究尚属空白。本研究通过临床检查表和社会适应能力量表对FXS男童进行评估，结果发现，六项简易临床检查表≥5分的切值更适合我国FXS男童的早期筛查，该切值既可以早期发现可能患FXS的男童，对其进行分子生物学诊断，提高了FXS的检出率，又可以使61.6％的可疑患儿避免进行脆性X综合征的实验室诊断，大大减少了诊断成本，而不会漏诊任何患儿。对确诊儿童的评估发现，中国FXS男童的注意缺陷/多动障碍(attention deficiency hyperactivity disorder，ADHD)的发生率明显高于其他国家的报道，可能与我们的患儿未积极进行药物治疗有关。同时，研究还发现，我国脆性X综合征男童的社会适应能力较差，明显落后于同年龄的正常儿童，与同智龄正常儿童和同智龄同年龄的唐氏综合征(Down syndrome，DS)儿童相仿，但是，各个维度发展不均衡，作业操作、参加集体活动和自我管理能力甚至落后于DS儿童。因此，要改善我国FXS儿童的临床症状和生活质量，需要加强早期诊断和积极治疗，以及针对患儿临床特征的特殊训练和教育。
　　脆性X综合征动物模型的应用，为神经病理学机制的研究提供了条件，进而促进了针对神经机制的靶向药物治疗的发展。本研究通过实时荧光定量RT-PCR和免疫组化、Western blot实验方法，对Fmr1基因敲除(knockout，KO)小鼠三个主要脑区(大脑皮层、海马和小脑)突触后致密物蛋白95(postsynaptic density protein95，PSD-95)mRNA及其蛋白质时空表达的改变进行了探索。结果发现，在这三个主要脑区中，PSD-95 mRNA及其蛋白质的表达在生后第7天(P7)最低，14天明显上升，在青春期或成年期达到高峰。与野生型对照组小鼠相比，Fmr1 KO小鼠不管在生长发育期(P7、P14、P21、P28)还是成年期(P90)，海马部位PSD-95 mRNA与蛋白质的表达水平均显著降低。因此，我们认为PSD-95在海马部位的表达受FMRP的调节，海马区PSD-95的受损与脆性X综合征患者海马依赖的学习功能障碍有关.该结果为进一步针对PSD-95途径的靶向治疗研究提供了依据。