人子宫内膜中S100A11调节胚胎着床的分子机制研究

摘要

胚胎着床是指胚泡进入子宫腔后与子宫内膜粘附，并逐渐埋入子宫内膜的过程。近年来，众多学者从细胞因子、粘附因子及其配基、免疫、激素等方面对胚胎着床进行了广泛而深入的研究，取得了巨大的成功，发现了许多新的因子和新的信息。本实验室在进行“蛋白质组学研究策略在早期妊娠流产以及卵泡发育潜能研究中的应用”相关研究时，发现早期妊娠丢失的绒毛组织中S100A11表达水平显著降低。该结论后被免疫组织化学证实。该研究暗示，S100A11可能在早期胚胎着床中扮演重要角色。S100A11是S100蛋白家族的成员之一。该家族成员是是一组低分子量的钙结合蛋白，与钙调蛋白及其他EF手型钙离子结合蛋白具有高度同源性。
　　 本文从临床调查、S100A11靶向性siRNA干扰的动物模型以及细胞学水平三方面，分别对子宫内膜中钙调蛋白S100A11表达、分布，以及其在胚胎着床中上下游调控机制进行研究。我们发现：分泌中期的子宫内膜中，S100A11大量分布于腔上皮，腺上皮；临床调查中发现，在难免流产的蜕膜组织中、不明原因不孕患者子宫内膜组织中，S100A11表达降低。而在管性不孕行IVF-ET治疗之后妊娠失败的患者子宫内膜调查结果中，S100A11表达显著性降低。为进一步分析子宫内膜中S100A11在胚胎着床过程中的作用，我们利用在体小鼠动物模型和体外细胞培养，结合靶向性siRNA干扰技术，发现S100A11的低表达水平能够直接影响胚胎的种植率，以及滋养细胞的粘附率。在对与胚胎种植息息相关的子宫内膜细胞容受和免疫耐受等的分子标记物的研究中，我们发现，低表达水平的S100A11能够使子宫内膜容受和免疫耐受相关的重要的标记分子发生显著性地改变，从而不利于子宫内膜容受及免疫耐受的形成。在对S100A11介导的胚胎着床分子机制研究中，我们发现，子宫内膜中的S100A11并不受雌激素、孕激素以及促绒毛膜性腺激素等的调控，相反表皮生长因子(EGF)能够上调S100A11的表达。而该现象的生物学意义在于，S100A11能够促进EGF诱导产生的胞内钙离子的升高。具体机制是：定位于细胞内内质网区域的S100A11作用于内质网钙库中钙离子通道，参与了调控内质网钙池中钙离子的释放和摄取，从而使内膜细胞维持在一个动态的钙平衡状态，有利于胚胎种植。
　　 第一部分S100A11在人子宫内膜组织中的表达、分布
　　 目的：确认S100A11在人子宫内膜细胞上的表达及分布，分析难免流产病人蜕膜组织中S100A11表达；分析不同妊娠结局的管性不育施IVF-ET治疗的病人中S100A11表达水平；分析不明原因不育患者子宫内膜中S100A11表达水平。
　　 方法：用免疫组化法检测S100A11在子宫内膜的定位，用Westernblotting法半定量检测S100A11的表达水平，用qRT-PCR法检测S100A11的表达水平mRNA。
　　 结果：
　　 1.免疫组织化学结果显示，S100A11主要定位于子宫内膜细胞的腺上皮和腔上皮，间质细胞上有弱表达。
　　 2.免疫组织化学的结果显示，在难免流产患者蜕膜组织中，S100A11表达较弱。
　　 3.不明原因不育患者内膜组织中S100A11mRNA的水平低于对照组，其中有3例患者明显S100A11mRNA水平明显低于平均值。
　　 4.管性不孕的妇女接受IVF-ET治疗后治疗失败组(failedpregnancy，23例)的中分泌期子官内膜中S100A11蛋白的表达明显水平低于治疗成功组(successfulpregnancy，15例)的妇女(P<0.05)。
　　 结论：S100A11表达于人子宫内膜上皮细胞中。在难免流产患者的蜕膜、不明原因患者的分泌中期内膜中，S100A11均呈现低水平，在接受IVF-ET治疗后妊娠失败的患者子宫内膜细胞中，S100A11的表达较低，这些临床资料均有力地暗示了S100A11在胚胎着床中发挥重要作用
　　 第二部分S100A11对胚胎种植的调控作用研究
　　 目的：应用体外粘附模型和在体siRNA干扰的动物模型来进一步验证S100A11是否参与对胚胎粘附和着床的调控，并利用siRNA体外干扰技术，观察S100A11对子宫内膜容受性标志性因子及免疫耐受相关细胞因子的直接调控作用。
　　 方法：
　　 1.建立靶向性siRNA干扰的在体小鼠胚胎种植模型，以特异性S100A11siRNA干扰受孕小鼠子宫内膜S100A11蛋白的表达，观察S100A11对胚胎种植结局的影响。
　　 2.以JAr和Ishikawa细胞构建体外粘附模型，通过siRNA干扰子宫内膜细胞中S100A11表达观察滋养细胞球粘附率的变化，评价S100A11在滋养细胞球粘附到子宫内膜细胞中的作用。
　　 3.利用子宫内膜Ishikawa细胞为体外模型，以特异性S100A11siRNA干扰内膜细胞中S100A11的表达，qRT-PCR和Westernblotting检测内膜容受相关因子(LIF、integrinβ3、claudin-4和DKK-1等)及免疫耐受相关细胞因子的变化。
　　 结果：
　　 1.在体的动物胚胎种植模型显示，子宫内膜中S100A11表达被敲减之后，胚胎着床率显著性地低于对照组(p<0.05)。
　　 2.体外粘附模型中，与对照组相比，S100A11靶向性siRNA组的滋养细胞球粘附率显著降低。
　　 3.子宫内膜Ishikawa细胞中，在S100A11蛋白表达明显降低的情况下，LIF，Integrinβ3，EGFR，claudin4和olfactomedin等重要内膜容受相关因子的表达水平发生显著性变化，胚胎着床时调控母胎免疫耐受的重要细胞因子表达发生显著性改变。
　　 结论：子宫内膜细胞中S100A11能够直接调节胚胎种植时重要的内膜容受相关基因的表达，进而影响胚胎粘附、着床。
　　 第三部分S100A11调控胚胎着床的分子机制研究
　　 目的：S100A11调控胚胎着床的信号调节机制
　　 方法：
　　 1.应用Westernblotting和qRT-PCR法检测雌激素(E2)、孕激素(P4)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)以及表皮生长因子(EGF)对子宫内膜细胞中S100A11是否存在直接调控作用。
　　 2.应用激光共聚焦显微镜及免疫电镜方法对子宫内膜细胞中S100A11进行亚细胞定位。
　　 3.应用显微荧光测定法联合S100A11靶向性siRNA干扰技术检测子宫内膜细胞中Ca2+的浓度变化和S100A11、EGF之间的关系。
　　 结果：
　　 1.子宫内膜细胞中S100A11的表达不受E2，P4以及hCG的调控，但是，EGF的刺激能够显著性上调子宫内膜细胞中S100A11的表达。
　　 2.激光共聚焦显微镜观察结果显示，大量S100A11分布在PDIA3(内质网标记物)区域，通过免疫电镜的方法同样发现，S100A11在内膜细胞的内质网区域有分布。
　　 3.钙离子检测结果显示，EGF促进了ATP引起的胞内钙离子的释放，但细胞中S100A11被敲减后，这个作用被抑制。
　　 4.EGF促进了由thapsigargin和Ryanodine引起的内质网中钙库的钙离子释放，但是，如果细胞胞内S100A11被特异性S100A11siRNA干扰后，该现象受到抑制。
　　 结论：胚胎着床时，子宫内膜细胞中的S100A11能够应答内源或外源性的EGF的刺激，显著性上调。S100A11能够促进EGF刺激引起的胞内钙离子的升高。定位于细胞内内质网区域的S100A11可能参与了调控内质网钙池中钙离子的释放和摄取，从而使内膜细胞维持在一个动态的钙平衡状态，有利于胚胎种植。