Collagenase A:A critical invasive factor in virulence of pathogenic Leptospira species

摘要

背景(background)：钩端螺旋体(简称钩体)分为致病性钩体和非致病性钩体两大类。非致病性钩端螺旋体存在于潮湿土壤和地表水中，属于腐生性愿核细胞型微生物，不引起人或动物疾病。致病性钩体中目前至少确定有7种基因种，如Leptospirainterrogans、Leptospiraborgpetersenii、Leptospirakirschneri和Leptospiraweilii等，其中问号钩体(L.interrogans)是流行最广的致病性钩体。由致病性钩体感染引起的钩体病是全球流行的人畜共患传染病，好发于热带或亚热带国家或地区，我国也是钩体病主要疫区之一。致病性钩体有强大的侵袭力，能迅速通过皮肤或黏膜侵入血流，引起中毒性败血症症状，如高热、头痛、肌痛等，钩体随血流侵入肺、肝、肾等脏器，引起肺出血、黄疸和肾功能损伤，常因呼吸或肾功能衰竭而导致死亡，其中肺弥漫性出血钩体病死亡率高达50％以上。鼠类和家畜是钩体主要动物宿主，感染钩体后虽无明显症状，但可长期甚至终身从尿液排出钩体，污染土壤或水系成为疫源地。然而，钩体不产生任何典型的外毒素，其脂多糖(LPS)毒性仅为大肠杆菌LPS的1/10～1/100,故钩体毒力因子及其致病机制至今所知甚少。细菌胶原酶可以有效降解宿主结缔组织及胞外基质(extracellularmatrix)中的胶原蛋白，是不少病原菌重要的侵袭性毒力因子之一。在问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组中，含有一个胶原酶编码基因(colA)。如前所述，致病性钩体有强大的侵袭力，但至今未见致病性钩体胶原酶功能及其致病性的研究报道。
　　 目的(aim)：了解钩体胶原酶水解不同胶原蛋白底物能力及特异性、最佳工作pH和金属离子浓度等酶动力学特征，采用问号钩体黄疸出血群赖型赖株胶原酶基因敲除突变株(colA￣)金地鼠感染模型，采用基因敲除技术了解钩体胶原酶基因对金地鼠毒力、肺和肝及肾组织中钩体载量及组织病变的影响，阐明钩体胶原酶工作机制及其致病意义。
　　 方法(methods)：以我国流行最广的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，采用高保真PCR扩增全长colA基因，T-A克隆后测序。以pET42a为表达载体、E.coliBL21DE3为表达宿主菌，构建胶原酶原核表达系统E.coliBL21DE3PET42a-colA。采用0.5mMIPTG28℃2诱导E.coliBL21DE3PET42a-colA表达重组ColA蛋白(rColA)、Ni-NTA亲和层析柱提纯rColA，采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检查rColA表达情况及提纯效果。采用多种胶原酶蛋白底物(多种胶原蛋白、Azocoll和Pz-肽)、不同pH和金属离子及浓度缓冲液，了解钩体重组胶原酶最佳胶原蛋白底物、pH和金属离子及其浓度等酶动力学特征。采用实时荧光定量RT-PCR及WesternBlot检测感染问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或人肾上皮细胞(HEK293)后colA基因表达水平变化及分泌情况。采用基于自杀质粒的基因敲除技术，构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株胶原酶基因敲除突变株(colA￣)。将不同浓度colA￣突变株或野生株腹腔注射攻击钩体敏感动物金地鼠，了解colA￣突变株或野生株对金地鼠毒力差异(LD50)。采集colA￣突变株与野生株感染金地鼠的肺、肝、肾组织标本，固定、包埋、切片后分别HE和银染色，观察各组织标本中钩体载量及组织病变的差异。
　　 结果(results)：我们克隆的钩体colA基因序列与GenBank中公布的问号钩体黄疸出血群赖型赖株钩体colA基因序列有很高的相似性。所构建的钩体colA基因原核表达系统EcoliBL21DE3PET42a-colA能有效表达目的重组蛋白rColA，Ni-NTA亲和层析柱纯化的rColA经SDS-PAGE后在凝胶中显示为单一的蛋白条带。rColA在37℃、pH7.4、0.4mMCaCl2-50mMTris-HCl缓冲液中有最佳水解底物的效果，尽管rColA能在不同程度上水解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白及Azocoll、Pz-肽广泛的底物特异性，但最佳水解底物为Ⅲ型胶原蛋白。WesternBlot检测结果显示，问号钩体黄疸出血群赖型赖株EMJH培养物上清中未检出ColA蛋白，但感染人脐静脉细胞(HUVEC)和人肾上皮细胞(HEK293)后colA-mRNA水平迅速升高并在感染细胞后6h达到峰值，问号钩体黄疸出血群赖型赖株与HUVEC或HEK293细胞共培养物上清中可检出ColA蛋白。问号钩体赖株colA￣突变株及野生株对金地鼠的LD50分别约为108和106。colA￣突变株感染的金地鼠肺、肝、肾组织中钩体载量明显低于野生株，肺、肝、肾组织病变也明显轻于野生株。
　　 结论(conclusion)：问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因表达产物ColA是一种胶原酶，对不同胶原酶底物具有广泛但不同程度的水解活性，但其最佳水解底物为Ⅲ型胶原蛋白。问号钩体赖株在体外培养基中不分泌ColA蛋白，但感染宿主细胞后ColA蛋白表达水平显著升高并可外分泌。colA基因敲除的问号钩体赖株对金地鼠毒力明显减弱，肺、肝和肾组织中钩体载量显著减少，组织病变程度也显著下降。综上所述，胶原酶ColA是在问号钩体致病过程中发挥重要作用的毒力因子。