竹笋降压降脂有效成分及其活性研究

摘要

竹笋(Bamboo shoots)是我国的大宗林副产品，水煮笋罐头是竹笋加工的主要产品形态。传统的水煮笋罐头是指以新鲜竹笋为原料，经去壳、漂洗、煮制等初级加工方式处理后，再经罐装、密封、杀菌等工艺制成的竹笋罐头。大罐的水煮笋罐头除直接进入流通领域以外，也常在工厂中作为小包装产品(尤其是方便调味笋制品)的原料。上述加工过程伴随着大量废弃物的产生，给产地带来很大的环保压力。本论文以水煮笋加工过程中的大宗废弃物(包括笋煮液、烫漂液、罐内液、下脚料压榨汁等，统称笋液)的开发利用为切入点，瞄准笋液中丰富的氨基酸、肽、多糖、黄酮和酚酸等次生代谢产物，以期挖掘出有益于人类健康的天然功能性素材。本论文以竹笋ACE抑制剂为重点研究对象，对其分离制备工艺、特征性成分的化学结构、体外ACE抑制活性以及体内降压、降脂功能进行了系统研究。现将主要研究成果归纳如下：
　　 1、经过预处理的浓缩笋液(AEBS)富含氨基酸(包括肽)，含量为21.32±1.16 g/100g干基；其次是多糖，含量为13.17±0.98g/100 g干基；此外，还含有一定量的黄酮和酚酸类化合物，总黄酮含量为1.41±0.12 g/100 g干基，酚酸含量为4.78±0.24 g/100 g干基。以AEBS为出发物料，以体外血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性和抗氧化活性(DPPH·、ABTS·+、FRAP)为评价和示踪指标，采用膜分离和大孔树脂吸附-解吸等技术进行精制，分别得到了具有较佳体外ACE抑制活性和抗氧化性能的竹笋ACE抑制剂(BSP)和竹笋粗多糖(多糖含量68.73±3.24 g/100 g)二个有效活性部位。
　　 2、通过对从AEBS中得到的竹笋粗多糖(膜截留分子量大于10 KDa)进行水解，结果表明，水解后总黄酮含量没有显著变化，但总酚含量大幅度增加。其中，酸水解样品总酚含量显著高于碱水解样品，尤其是对香豆酸和阿魏酸含量显著增加。这可能是由于在酸水解过程中，竹笋粗多糖中的多糖酚酸酯解构释放出游离酚酸所致。与粗多糖及其碱水解样品相比，酸水解样品表现出更强的抗氧化性能和体外ACE抑制活性。结果还表明，不同试样中总酚含量与其抗氧化活性和体外ACE抑制活性呈显著正相关。
　　 3、采用乙酸乙酯和正丁醇对竹笋ACE抑制剂(BSP)水溶液进行分级萃取，乙酸乙酯相(BSME)表现出最强的抗氧化活性，水分级相(BSML)表现出最强的体外ACE抑制活性最强的为水分级相(即剩余相)。对乙酸乙酯相(BSME)、正丁醇相(BSMB)和水分级相(BSML)进行抗氧化和体外ACE抑制活性评价，结果表明抗氧化活性与黄酮含量呈正相关，而氨基酸含量与体外ACE抑制活性呈正相关。以水分级相(BSML)为出发材料，以体外ACE抑制活性为指征，采用Sephadex G-15凝胶对BSML进一步分离纯化，得到活性最强的部位P2。以半制备反相高效液相色谱对P2组分进行分离制备，得到高活性组分P2-2，采用UPLC-ESI-MS进行结构解析，确定活性二肽为天冬氨酸-酪氨酸(Asp-Tyr)。委托相关机构，对上述特征性竹笋肽进行化学合成，获得了g级Asp-Tyr二肽试样。
　　 4、竹笋ACE抑制剂(BSP)中富含氨基酸、肽和多酚类化合物，质量指标为：氨基酸总量42.78±0.57 g/100 g，总黄酮含量5.07±0.47 g RE/100 g，酚酸含量为10.91±0.98 gGAE/100 g。对BSP改善高脂血大鼠心血管功能和氧化应激试验研究表明，高剂量BSP(350 mg/day kg BW)能显著降低高脂血症大鼠血清总胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c)含量和动脉粥样硬化指数(Atherosclerosis index，AI)，抑制肝脏中脂肪酸合成酶(FAS)活性；中剂量BSP(200 mg/day kg BW)能有效降低大鼠肝脏TC、TG水平；低剂量BSP(100 mg/day kg BW)能有效降低大鼠肝脏TC水平。各剂量BSP组均可显著改善高脂血大鼠的氧化应激状态，提高机体内源性超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活力，降低肝脏丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量。
　　 5、本部分实验以自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHRs)为试验模型评价BSP的降压作用。一次性降压实验表明，给药4h～6h后，100 mg/day kg BW剂量BSP降压效果与10 mg/day kg BW剂量的阳性对照药物卡普托利(Captopril)接近；50 mg/day kg BW BSP降压效果与10 mg/day kg BW合成二肽Asp-Tyr相当。在上述试验的基础上，对SHR大鼠进行连续四周的降压试验，设以下六个试验组：SHR对照组、阳性对照组(Captopril，10 mg/day kg BW)、BSP二个剂量组(50 mg/day kg BW和100mg/day kg BW)、合成肽组(Asp-Tyr，10 mg/day kg BW)以及BSP和竹茹三萜(EZR2002)复配组(BSP50 mg/day kg BW+EZR200250 mg/day kg BW)。试验结果表明：(1)连续给药不同剂量的BSP7 d后，大鼠血压开始下降，21 d实验组血压与空白组对比差异明显；BSP与EZR2002复配协同增效降压效果最为显著，显示出良好的降压效果。(2)不同剂量BSP均能有效抑制SHR大鼠肺部组织中的ACE活性，并呈现剂量依赖关系(P<0.05)。BSP与EZR2002复配协同增效，显著抑制肺部ACE活性(P<0.01)。(3)合成肽(10 mg/day kg BW)显著提高血清GSH-Px活性(P<0.05)；不同受试剂量的BSP均可显著提高显著升高血清SOD、GSH-Px酶活力和肝脏总抗氧化能力，升高血清一氧化氮(Nitric oxide，NO)水平，增加肾脏一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)活性，并呈现剂量效应；BSP与EZR2002复配可显著增加血清SOD(P<0.01)、GSH-Px(P<0.01)活力，肾脏NOS活性(p<0.01)，降低血清和肝脏MDA水平(P<0.01)。
　　 本研究结果表明，源自罐头笋加工废液的功能性食品素材--竹笋ACE抑制剂(BSP)富含竹笋有效成分(氨基酸、寡肽、黄酮和酚酸类化合物等)，是竹笋的最佳有效活性部位。体内外试验研究均表明，BSP具有高效ACE抑制活性和显著的降压、降脂、抗氧化功能，能显著改善高脂血大鼠脂质代谢和氧化应激状态、降低SHR大鼠的血压、改善SHR大鼠的氧化应激状态。鉴于我国丰富的竹笋资源及其巨大的笋加工副产物总量，从竹笋中挖掘天然来源的ACE抑制剂具有特殊的理论意义和现实意义，既能为心血管疾病的膳食防治找到新的手段和途径，同时又能推动竹产业的资源转化和技术进步。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 竹资源概况及竹子化学素研究现状

1．1．1 竹资源简况

1．1．2 竹子化学素

1．1．3 我国竹产业现状

1．2 竹笋资源

1．2．1 竹笋的营养价值

1．2．2 竹笋的保健功能

1．2．3 竹笋加工业面临的问题

1．2．4 竹笋有效成分及研发趋势

1．3 类黄酮与动脉粥样硬化

1．3．1 动脉粥样硬化

1．3．2 类黄酮防治AS的作用机制

1．3．3 类黄酮防治AS的作用及构效关系

1．4 高血压

1．4．1 传统医学对高血压的认知

1．4．2 高血压发病机制

1．4．3 血管紧张素转化酶(ACE)

1．4．4 ACE抑制肽

1．5 本课题立项背景和研究目的

第二章 笋液中寡肽的膜分离工艺研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要化学试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 结果与讨论

2．2．1 单因素试验对超滤效果的影响

2．2．2 超滤操作条件的优化

2．3 本章小结

第三章 竹笋ACE抑制剂的分离纯化和特征性成分鉴定

3．1 材料和仪器

3．1．1 材料

3．1．2 主要化学试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 大孔树脂吸附-解析法精制竹笋ACE抑制剂

3．2．2 Sephadex G-15分离竹笋ACE抑制剂

3．2．3 半制备高效液相(RP-HPLC)制备竹笋ACE抑制剂特征性成分

3．2．4 UPLC-ESI-MS分析竹笋ACE抑制剂特征性成分

3．2．5 总黄酮含量测定

3．2．6 酚酸含量测定

3．2．7 体外ACE抑制活性测定

3．2．8 氨基酸分析

3．2．9 蛋白质含量测定

3．3 结果与分析

3．3．1 大孔树脂DA201-C精制竹笋ACE抑制剂

3．3．2 Sephadex G-15分离BSP中ACE抑制活性组分

3．3．3 半制备高效液相色谱(RP-HPLC)制备竹笋ACE抑制剂特征性成分

3．3．4 UPLC-ESI-MS分析竹笋ACE抑制肽活性最高部位P2-2

3．4 本章小结

第四章 竹笋粗多糖的体外抗氧化评价及ACE抑制活性研究

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 主要化学试剂

4．1．3 主要仪器设备

4．1．4 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 水解对竹笋粗多糖总黄酮和酚酸含量的影响

4．2．2 水解对竹笋粗多糖酚性化合物含量的影响

4．2．3 水解对竹笋粗多糖抗氧化活性的影响

4．2．4 水解对竹笋粗多糖体外ACE抑制活性的影响

4．3 本章小结

第五章 BSP及分级相的体外ACE抑制活性及抗氧化活性评价

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 主要化学试剂

5．1．3 主要仪器设备

5．1．4 实验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 BSP及各分级相中的总黄酮和酚酸含量测定

5．2．2 BSP及分级相中酚性化合物的检测结果(RP-HPLC法)

5．2．3 BSP及分级相体外ACE抑制活性

5．2．4 BSP及分级相体外抗氧化活性

5．3 本章小结

第六章 竹笋ACE抑制剂调节大鼠脂代谢和抗氧化应激试验研究

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 主要试剂和仪器设备

6．1．3 试验分组

6．1．4 实验方法

6．2 结果与分析

6．2．1 血脂水平分析

6．2．2 抗氧化指标分析

6．2．3 BSP对高脂血大鼠肝脏脂肪酸合酶活性的影响

6．3 结果与讨论

第七章 竹笋ACE抑制剂降低SHR大鼠血压的试验研究

7．1 材料和方法

7．1．1 材料

7．1．2 主要化学试剂

7．1．3 实验仪器

7．1．4 实验方法

7．2 结果与讨论

7．2．1 一次性降压试验

7．2．2 SHR大鼠30天降压实验

7．3 本章小结

第八章 结论与展望

8．1 主要结论

8．2 创新点

8．3 展望

参考文献

致谢

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