筛选和鉴定一群新内的CD44highCD58high大肠癌干细胞

摘要

大肠癌是常见恶性肿瘤，在我国其发病率已居恶性肿瘤的第3-4位。大肠癌组织存在的大肠癌干细胞是大肠癌浸润、复发、转移和耐药的重要原因之一。识别不同的肿瘤干细胞标志物有助于深入研究肿瘤干细胞功能特性及干细胞特性维持相关分子机制，靶向杀死肿瘤干细胞，预防肿瘤复发和转移。目前研究已报道CD133、CD44、CD26和ALDH1等为大肠癌干细胞的分选标志。然目前有关不同干细胞标志物的功能和特性维持分子机制各不相同，大肠癌干细胞是否存在其它不同的功能亚群目前尚不明了。本研究通过体外克隆球富集和高通量筛选方法鉴定了一群新的CD44highCD58high大肠癌干细胞群，流式细胞术(FCM)检测发现大肠癌细胞株SW620、LoVo、HT29和原代大肠癌分离细胞中均存在少量的CD44highCD58high细胞，免疫组化检测亦发现肿瘤组织存在CD44highCD58high细胞。药物富集试验证明经5-FU处理后CD44highCD58high细胞比例明显升高，且CXCL-8分泌水平升高，小鼠成瘤试验证明其致瘤能力高于CD44lowCD58low组。本研究提示CD44highCD58high是一群新的具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群，其功能可能与促进血管生成有关，有关其生物学功能功能及分子机制有待进一步研究。
　　 实验目的：
　　 本研究通过无血清培养SW620细胞聚集大肠癌干细胞的方法，芯片扫描cDNA表达谱，分析并筛选了CD44和CD58干细胞分子标记物，验证其在大肠癌细胞系和原代大肠癌分离细胞表达情况，并通过免疫组化验证组织中表达情况。通过药物富集、NOD/SCID小鼠成瘤实验鉴定其干细胞特性。结合基因芯片结果，通过药物富集实验检测经药物作用细胞CXCL-8的表达情况，为进一步研究生物学功能及分子机制打下基础。
　　 实验方法：
　　 1.为了筛选候选的大肠癌干细胞标志物,我们用无血清培养基培养SW620细胞浓聚肿瘤干细胞，待成球后收集克隆球细胞，cDNA表达谱芯片筛选改变的CD分子，发现CD44和CD58发生改变并作为候选的干细胞标志物进行研究。
　　 2.为检测CD44和CD58的表达情况，我们用流式细胞术(FCM)分别检测大肠癌细胞系SW480、SW620、 LoVo、HT29，原代大肠癌组织分离细胞CD44highCD58high细胞百分比;共聚焦显微镜下观察克隆球细胞CD44和CD58共表达情况;免疫组化确认大肠癌组织CD44和CD58共表达情况。
　　 3.干细胞特性验证:为验证这群细胞的干细胞特性，我们利用化疗药物短期作用浓聚肿瘤干细胞原理，用化疗药物5-FU作用大肠癌细胞系2周，FCM检测CD44highCD58high细胞百分比改变。FACS分选 CD44highCD58high和CD44lowCD58low细胞，进行NOD/SCID小鼠成瘤试验比较两者致瘤能力。
　　 4.功能特性验证:结合基因芯片检测结果，通过Real-Time PCR和ELISA分别在mRNA和蛋白水平测定5-FU药物作用后CXCL-8表达变化。
　　 实验结果：
　　 1.无血清培养基培养大肠癌细胞浓聚肿瘤干细胞后，cDNA表达谱芯片显示克隆球细胞CD44和CD58表达较对照组升高，筛选CD44和CD58作为候选的大肠癌干细胞标志物。
　　 2.FCM检测结果显示大肠癌细胞系和原代大肠癌分离细胞存在少量的CD44highCD58high细胞，其中细胞系CD44highCD58high细胞百分比介于3.2％-4.6％之间，原代大肠癌分离细胞则介于0.5％-10％之间波动;共聚焦显微镜下显示部分克隆球细胞共表达CD44和CD58。免疫组化确认大肠癌组织中亦存在CD44highCD58high细胞。
　　 3.化疗药物短期作用的大肠癌细胞， CD44highCD58high细胞比例明显上升。同样，动物致瘤实验提示CD44highCD58high细胞致瘤能力高于CD44lowCD58low组。
　　 4.RT-PCR及ELISA结果显示药物作用后的大肠癌细胞CXCL-8表达水平升高。
　　 结论：
　　 CD58是新的大肠癌干细胞标志物，CD44highCD58high细胞是一群具有干细胞特性的大肠癌干细胞亚群。这群细胞具有分泌细胞因子CXCL-8的功能。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略词

引言

1．材料

1．1 细胞株与小鼠

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

2．方法

2．1 高通量筛选方法筛选CD44和CD58作为大肠癌干细胞标志物

2．2 检测CD44和CD58表达情况

2．3 干细胞特性验证

3．实验结果

3．1 CD44和CD58分子标志物筛选

3．2 CD44highCD58high细胞表达情况

3．3 干细胞特性验证

3．4 功能特性验证

4．讨论

5．结论

参考文献

综述 大肠癌干细胞干性维持相关通路及其标志物研究进展

作者简历及在学期间取得的科研成果