一群新的CD44high CD58high大肠癌细胞的干细胞特性鉴定及其分子机制研究

摘要

背景:
　　大肠癌是常见消化道恶性肿瘤之一，发病率和死亡率居常见肿瘤第3位，转移和复发是大肠癌致死主要原因，深入研究大肠癌发生发展的分子机制有助于改善大肠癌临床预后。大肠癌肿瘤干细胞是大肠癌组织中一小部分增殖缓慢、具有自我更新和多向分化能力的干细胞样肿瘤细胞，在大肠癌发生、转移复发和治疗抵抗中起重要作用。自我更新是大肠癌干细胞的主要特征，也是其上述恶性生物学行为的根源。Wnt、Notch、Hedgehog、TGF-β、PI3K/Akt等通路参与了大肠癌干细胞自我更新的调控，其中Wnt通路对大肠癌干细胞自我更新的维持起支配性作用。
　　肿瘤干细胞具有多个干性相关细胞表面分子标志物，用于肿瘤干细胞鉴定和分选。目前已发现大肠癌干细胞具有多个表面分子标志包括CD133、CD44、CD24等，标记具有不同生物学功能的干细胞亚群，新的大肠癌干细胞分子标志有待进一步发现。这些分子标志与自我更新的调控关系是目前研究热点，如CD44对大肠癌干细胞自我更新具有促进作用，然而其他分子标志是否或如何参与调控自我更新尚不明确。另外，表面分子标志也可通过与大肠癌局部微环境中免疫细胞表面配体或受体相互作用而影响自我更新，其具体机制尚待研究。因此，大肠癌干细胞表面分子标志与自我更新调控关系的研究不仅可进一步阐明肿瘤干细胞恶性生物学行为的发生发展机制，也可为靶向清除大肠癌干细胞提供新的治疗靶点和研究思路。
　　目的:
　　本研究主要以大肠癌HT29、SW620细胞系和原代大肠癌P1细胞系为研究对象，筛选和鉴定大肠癌干细胞新的表面分子标志;检测和鉴定新发现的CD44highCD58high大肠癌干细胞表达水平及其肿瘤干细胞特征;研究新的表面标志分子CD58在大肠癌干细胞中分子生物学功能及其作用机制;初步探究Snail/CXCL-8轴对CD44highCD58high大肠癌干细胞干性特征影响及其调控机制，从而阐明CD44highCD58high大肠癌干细胞的恶性生物学功能。
　　方法:
　　通过体外无血清低粘附培养富集大肠癌干细胞，采用全基因cDNA表达谱芯片筛选其中差异表达CD分子作为候选干细胞标志物，以免疫荧光检测验证。流式细胞术检测大肠癌细胞系和原代大肠癌组织中CD44highCD58high大肠癌细胞表达水平。采用克隆球形成试验、动物连续致瘤实验和化疗药物富集试验等鉴定CD44highCD58high大肠癌细胞的肿瘤干细胞特征，并评价其与已知大肠癌干细胞亚群之间的关系。为研究CD58对自我更新的调控作用，采用荧光素酶双报告基因法检测过表达或激活CD58对Wnt通路活性影响，同时利用慢病毒转染观察沉默CD58对体外克隆球形成和体内移植瘤形成的影响。结合cDNA表达谱芯片分析、免疫共沉淀、western blot及克隆球形成实验等鉴定CD58上调Wnt通路活性的作用靶蛋白。采用荧光素酶报告基因和western blot检测Snail对CD44和CD58转录和表达的影响，并观察CXCL-8对体外克隆形成的影响，初步研究Snail/CXCL-8轴对这群细胞干性特征的调控作用。
　　结果:
　　1、大肠癌干细胞CD44和CD58表达升高，CD44highCD58high大肠癌细胞具有显著肿瘤干细胞特征。
　　基因芯片筛选结果示CD44和CD58在大肠癌干细胞中表达显著升高，对大肠癌细胞系和19例原代大肠癌组织流式细胞检测结果示CD44highCD58high大肠癌细胞普遍存在，其表达水平为0.5～10.0％。体内外实验结果示CD44highCD58high大肠癌细胞具有更强的体外克隆球形成、动物体内致瘤和上皮间充质转化能力，且体内外均可被化疗药物5-FU和奥沙利铂短期作用显著富集，提示CD44highCD58high大肠癌细胞具有肿瘤干细胞特性。
　　2、CD44highCD58high大肠癌细胞是CD133+细胞的一个亚群。
　　对大肠癌细胞系、原代大肠癌组织和大肠癌肿瘤克隆球行流式细胞检测结果示CD133+大肠癌细胞中CD44highCD58high细胞比例显著高于CD133-大肠癌细胞(P＜0.05)，提示CD44highCD58high大肠癌细胞是CD133+细胞的一个亚群。而CD44highCD58high细胞与CD44+CD24+细胞分布重合率很低，无重叠分布。
　　3、CD58能上调Wnt通路活性而促进大肠癌肿瘤干细胞特征和自我更新。
　　荧光素酶双报告基因方法检测结果示瞬时过表达CD58后大肠癌细胞Wnt通路活性上调，使用CD58交联抗体TS2/9或CD58受体重组人CD2分子作用大肠癌细胞激活CD58也能上调Wnt通路活性，体外实验示克隆球形成能力增加。使用慢病毒感染成功构建CD58稳定抑制细胞，体内外实验结果示沉默CD58导致克隆球形成减少并显著抑制体内移植瘤成瘤率和生长速度。
　　4、大肠癌中CD58通过结合并降解Dickkopf3上调Wnt通路活性。
　　免疫共沉淀结果示CD58能与Dickkopf3(Dkk-3)结合，瞬时过表达CD58后Dkk-3出现降解现象。荧光素酶双报告基因检测结果示大肠癌细胞过表达Dkk-3抑制Wnt通路活性，构建Dkk-3稳定抑制大肠癌细胞后再过表达CD58，Wnt通路活性不能上调，提示CD58与Wnt通路负性调控因子Dkk-3结合并导致其降解，从而上调Wnt通路活性而促进自我更新。
　　5、Snail/CXCL-8轴与CD44、CD58和大肠癌干细胞自我更新存在调控关系。
　　Western blot结果示转录因子Snail在CD44+大肠癌细胞表达增加，瞬时过表达Snail后CD58表达增加同时荧光素酶活性检测结果示Snail调控CD58的转录。ELISA结果示CD58与T淋巴细胞表面CD2相互作用促进CXCL-8分泌，体外实验示CXCL-8可促进大肠癌体外克隆球形成能力。
　　结论:
　　CD44highCD58high大肠癌细胞是一群新的大肠癌干细胞，CD58是一个新的参与调控大肠癌干细胞自我更新的分子标志。激活CD58通过结合和降解Dkk-3上调Wnt/β-catenin通路活性进而促进大肠癌干细胞自我更新。Snail/CXCL-8轴对CD44highCD58high大肠癌干细胞自我更新也有促进作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

主要仪器设备

引言

1 第一章 CD44highCD58high大肠癌细胞的发现及干性特征鉴定

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

2 第二章 CD44highCD58high大肠癌细胞与已知干细胞亚群的关系研究

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

3 第三章 CD58促进大肠癌干细胞自我更新及其分子机制研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

4 第四章 CD58上调Wnt通路活性的作用靶蛋白鉴定

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

5 第五章 Snail／CXCL-8轴与CD44、CD58和自我更新的调控关系

5．1 材料和方法

5．2 结果

5．3 讨论

全文结论

参考文献

CD44与肿瘤干细胞和肿瘤发生的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果