妊娠期间歇低氧诱导大鼠子代类焦虑样行为的CRH1型受体表观遗传学机制研究

摘要

流行病学调查研究发现，妊娠期应激可以导致子代多种神经精神类疾病的易感性和行为反应的改变。子代神经与精神类疾病的发生，往往来源于其胚胎发育期神经系统的发育紊乱。这类胎源性疾病发生的分子机制至今尚不十分清楚，目前认为可能与胚胎发育内环境改变与胎儿脑内基因编码相互作用，发生如DNA甲基化有密切的关系。
　　 母体妊娠期低氧应激，是有害于胎儿发育的重要因素之一，其对子代健康有深远的影响。在高原地区生活或者妊娠伴有贫血症、高血压、呼吸睡眠综合症和先兆子痫等疾病时，均会引发妊娠期胎儿低氧或缺氧。我们实验室的以往工作显示，妊娠期间歇低氧可以导致HPA轴敏感化并诱发子代类焦虑样行为的出现，这与PVN区CRHR1受体的激活相关，但是CRHR1激活的分子机制尚未阐明。本论文旨在阐述妊娠期间歇性低氧诱导子代发生性别依赖性类焦虑样行为的Crhr1基因表观遗传修饰的分子机制。
　　 我们发现，妊娠期母鼠每天暴露于高原低氧（人工低气压舱模拟5km海拔，相当于海平面10.8％ O2）4小时，诱导了成年雄性子代成年大鼠类焦虑样行为，对雌性无影响。这种作用与生后90天(P90)子代下丘脑PVN区和胚胎发育19天(E19)下丘脑中CRHR1 mRNA高表达有关。雌性E19下丘脑CRHR1 mRNA表达下降而CRHR2 mRNA表达升高，这与CRHR1和CRHR2蛋白表达变化相一致，进而发现磷酸化ERK1/2蛋白的表达水平也明显升高。该结果提示，在下丘脑区，CRHR2可能通过激活Ras-MAPK信号通路参与调控CRHR1的下调。
　　 我们利用qPCR技术检测了CRHR1和CRHR2的mRNA在子代生后发育期下丘脑PVN区、CeA区和垂体组织中的表达情况。发现在PVN区，妊娠期间歇低氧降低P7天雌性子代CRHR1 mRNA的表达水平，对P1至P21天雄性子代无影响。此外，升高P14天雌性子代CRHR2 mRNA水平，对雄性子代无明显影响。在P7天时，雌性和雄性子代CRHR1∶ CRHR2的比值降低;在垂体组织中，妊娠期间歇低氧明显降低P1和P14天雄性子代CRHR1 mRNA的表达，明显升高P7天雄性子代CRHR2 mRNA表达。同时，P1天雄性子代CRHR1和CRHR2比值下降而雌性子代该比值的升高，P7天雌、雄子代CRHR1和CRHR2比值均下降;在CeA区，妊娠期间歇低氧降低P1天雄性子代CRHR1 mRNA的表达，升高P14天CRHR1 mRNA的表达，降低P7天雌性子代CRHR1mRNA的表达。妊娠期间歇低氧还可以升高P1天到P14天雌性子代CRHR2 mRNA的表达，但对雄性子代无影响。P1天雌性子代和P21天雄性子代CRHR1和CRHR2比值下降，以及P7和P14天雌雄子代CRHR1和CRHR2比值下降。
　　 此外，我们应用MethPrimer-Design Primers for Methylation PCRs软件，分析大鼠Crhr1基因启动子区CpG岛的分布格局，发现在Crhr1基因的启动子区有两个CpG岛（岛1和岛2），岛1位于转录起始位点上游的-607到-502bp的区域，岛2则位于第一外显子区上游-6到+429bp的区域。双荧光素酶报告基因检测显示，岛1是调节Crhr1基因转录活性的主要调控区域。之后，我们对启动子区起主要调控作用的岛1内9个CG位点的甲基化修饰水平进行了检测，结果显示;E19天的雄性子代下丘脑区-535位胞嘧啶的甲基化修饰水平明显降低，这与雄性子代CRHR1mRNA表达升高相一致，而E19天雌性子代-547位胞嘧啶的甲基化修饰水平明显升高，这与CRHR1 mRNA表达降低相一致。在生后发育期和成年期，在P1、P14和P90天的雄性子代PVN区，始终存在-535位CG位点的甲基化修饰水平的下降，同时妊娠期间歇低氧还可以导致P90天雄性子代PVN区Crhr1基因-587、-561、-547和-544位胞嘧啶甲基化修饰水平的下降，但对雌性子代Crhr1基因的9个CG位点的甲基化水平无影响。在垂体组织中，妊娠期间歇低氧明显降低P1天雄性子代-547、-544和-535位胞嘧啶的甲基化修饰水平和升高P1天雌性子代-544位胞嘧啶，P14和P90天-561位胞嘧啶的甲基化修饰水平。在CeA区，妊娠期间歇低氧可以明显升高P1天雌雄子代-552、-547、-544和-535位CG位点的甲基化水平，并且仅明显升高P90雄性子代-579、-552和-547位CG位点的甲基化水平。此外，P90天PVN区和E19天下丘脑组织内Crhr1基因CG位点甲基化修饰水平改变主要受该组织中DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)的调控。细胞实验显示，Crhr1基因启动子区-547位CG位点的突变可以降低该基因的基础转录活性，这意味着该位点的碱基序列可能是影响转录因子与Crhr1基因结合的关键区域。另外，-604位、-587位、-579位、-547位、-544位和-535位突变载体的甲基化修饰不会再引起Crhr1基因的转录调控的下调，而-561位、-552位和-537位突变载体的甲基化修饰依然可以下调Crhr1基因的转录调控活性活性，由此可见，-604位、-587位、-579位、-547位、-544位和-535位的CG位点是影响CRHR1表达的主要位点。提示发育期间的Crhr1基因甲基化修饰可能受多种因素的调节，胎源起因是其中之一，同时也受到生后发育生理调节和环境变迁的复杂作用。
　　 综上所述，妊娠期间歇低氧可以诱导子代类焦虑样行为的出现，并且这种行为学改变具有雄性特异性特点以及PVN区CRHR1 mRNA高表达的性别依赖性特点，提示两者有相关性。妊娠期间歇低氧降低DNMT3b的表达，可能是低氧上调Crhr1基因表达的机制之一，也是Crhr1基因甲基化修饰性别特异性的根源。本研究首次提出了妊娠期低氧应激诱导子代类焦虑样行为的Crhr1基因表观遗传学修饰起因假设，阐述了DNMT3b关联的Crhr1基因去甲基化触发了Crhr1基因的激活，是导致类焦虑样行为形成的分子基础，从而为临床干预提供了有意义的科学依据。

目录

声明

致谢

前言

参考文献

摘要

缩略词

第一章 妊娠期间歇低氧诱导成年子代大鼠类焦虑样行为及CRHR1表达的性别差异性

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 妊娠期间歇低氧对子代胚胎及生后发育期CRHR1表达的性别差异性

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三章 妊娠期间歇低氧对子代Crhr1基因甲基化修饰机制

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

全文总结

综述 应激与CRH及其受体研究进展

作者简历及在读期间所得的科研成果