pH响应智能聚合物用于基因输送研究

摘要

尽管非病毒基因输送系统在肿瘤基因治疗领域具有广阔的应用前景，但由于人体和肿瘤微环境中存在多重屏障，使非病毒基因输送系统的效率、安全性及体内应用受到严重限制。鉴于肿瘤组织具有一些区别于正常组织的结构和代谢特点（如肿瘤的酸性环境、肿瘤细胞内高活性氧自由基等），可以通过设计对肿瘤组织某种环境特性敏感的基因载体结构，实现肿瘤靶向释放，从而提高治疗疗效和降低毒副反应。目前对环境响应性基因输送体系的设计中以pH响应的聚合物最受广泛关注和重视。 本论文的主要研究工作是设计并合成了两种含有pH响应基团的聚合物，并对其作为智能基因输送载体的功能进行了研究，期望通过其在肿瘤组织中的结构和功能变化来克服基因输送过程中的主要屏障，实现高效基因输送。 第一部分工作中，我们将丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEA)通过迈克尔加成的方式嫁接到支链状PEI(bPEI，25 kDa)骨架上，形成pH响应可降解聚合物PEI-DMAEA。PEI-DMAEA表现出pH敏感水解特性，在酸性条件下水解速率较慢，但在生理pH下聚合物很快发生水解，其表面电势很快从正电变为负电。这种特性使PEI-DMAEA与DNA形成的复合物被细胞内吞到内涵体之后，DNA能够得到有效地保护，而当复合物从内涵体逃逸到胞浆后，PEI-DMAEA快速水解并发生由正电向负电的电荷反转过程，随之将DNA彻底释放。实验表明，N/P在10以上时，PEI-DMAEA能够将DNA完全包裹并压缩，形成的纳米复合物粒径约150 nm。但由于PEI-DMAEA在生理条件下水解速度过快，导致其与DNA形成复合物的基因转染效率偏低，最高仅7.40％。为调节PEI-DMAEA的水解速率，进一步利用碘甲烷将PEI-DMAEA中的部分三级胺季胺化。季胺化后，聚合物的水解速率明显降低，且季胺化程度越高水解速率越慢。选取40％、50％、60％季胺化的聚合物，在N/P为40时对DNA进行压缩包裹，并进一步在所形成的纳米颗粒表面包裹一层带有负电荷的乙氧基甲基丙烯酸(EOMA)和丙氧基甲基丙烯酸(POMA)的共聚物（pEP，EOMA与POMA的摩尔比为1∶1），最终获得带负电的pEP/PEI-DMAEA/DNA纳米复合物。研究发现，pEP/PEI-DMAEA/DNA纳米复合物的细胞摄取效率及基因转染效率均有了显著提高，最高转染效率可达未修饰PEI/DNA复合物转染效率的2倍。 第二部分工作是在赖氨酸基础上，设计合成新型可降解非病毒基因载体聚赖氨酸苄酯。HPLC的表征显示，在pH7.4条件下，聚赖氨酸苄酯50 h后的水解达到100％，然而在pH5.0条件下只水解40％左右，表明该新型聚合物具有pH敏感的水解特性。在体外培养的H1299人肺癌细胞系和H印G2肝癌细胞系中，聚赖氨酸苄酯的细胞毒性较PEI(25 kDa)相比明显降低，提示其具有良好的生物相容性。同时，在N/P比率较低的情况下，聚合物已能很好地与DNA络合并形成稳定的、粒径约150 nm的纳米复合物。DNA酶降解实验证实聚合物能够充分保护DNA免于被DNA酶降解。利用体外培养的H1299细胞及激光共聚焦显微镜、流式细胞分析等技术，我们观察了聚合物/DNA纳米复合物的亚细胞分布并检测了纳米复合物介导的基因转染效率。在处理细胞24 h后，纳米复合物主要粘附在细胞膜上，小部分进入内涵体中，而处理36 h后纳米复合物主要存在于内涵体中。基因转染实验表明，在氯喹存在的实验情况下，纳米复合物介导的基因转染效率高达40％左右，与PEI/DNA纳米复合物介导的转染效率相当，但其毒性较PEI明显降低。 简言之，本论文设计和研究的两种新型pH响应智能聚合物值得做进一步深入研究和优化，并有望为基因治疗提供高效低毒的非病毒输送载体。

目录

声明

致谢

摘要

缩写、符号清单和术语表

第一章 前言

1．1 基因治疗简介

1．2 肿瘤及其微环境

1．2．1 肿瘤

1．2．2 肿瘤微环境

1．3 基于pH响应特性的非病毒基因输送体系

1．3．1 pH催化可降解聚合物

1．3．2 组氨酸修饰的聚合物载体

1．3．3 烷基丙烯酸酯类聚合物

1．4 聚乙烯亚胺

1．5 课题的提出

第二章 实验材料与仪器

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 质粒

2．4 细胞

2．5 工作溶液

2．5．1 常规溶液

2．5．2 实验所用MTT

第三章 可降解电荷反转PEI衍生物用于基因输送的研究

3．1 引言

3．2 实验方法

3．2．1 质粒扩增与提取

3．2．2 细胞培养

3．2．3 p(EOMA-POMA)共聚物(pEP)的合成

3．2．4 p(EOMA-POMA)共聚物(pEP)的转变pH检测

3．2．5 p(EOMA-POMA)共聚物(pEP)的溶血能力检测

3．2．6 PEI-DMAEA的合成

3．2．7 PEI-DMAEA的季胺化

3．2．8 PEI-DMAEA在不同pH缓冲溶液中的电荷变化情况

3．2．9 不同程度季胺化的PEI-DMAEA在pH 7．4缓冲溶液中的电荷变化

3．2．10 PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的制备

3．2．11 pEP／PEI-DMAE／DNA纳米复合物的制备

3．2．12 纳米复合物物理性能测定

3．2．13 DNA凝胶阻滞电泳实验

3．2．14 细胞毒性实验

3．2．15 pEP／PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的细胞摄取量检测

3．2．16 pEP／PEI-DMAEA／DNA纳米复合物亚细胞分布实验

3．2．17 pEP／PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的体外细胞转染

3．2．18 激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达

3．3 结果与讨论

3．3．1 阴离子聚合物pEP的化学表征

3．3．2 阴离子聚合物pEP的亲疏水转变pH检测

3．3．3 阴离子聚合物pEP的溶血实验

3．3．4 PEI-DMAEA的化学表征

3．3．5 PEI-DMAEA的细胞毒性检测

3．3．6 PEI-DMAEA在不同pH缓冲溶液中的电荷变化情况

3．3．7 PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的表征

3．3．8 DNA从PEI-DMAEA／DNA纳米复合物中的释放

3．3．9 PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的体外基因转染

3．3．10 不同程度季胺化的PEI-DMAEA在pH 7．4缓冲溶液中的电荷变化

3．3．11 pEP／PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的表征

3．3．12 pEP／PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的表征

3．3．13 pEP／PEI-DMAEA／DNA中聚合物与DNA络合及对DNA的保护

3．3．14 pEP／PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的细胞毒性检测

3．3．15 pEP／PEI-DMAEA／DNA纳米复合物的细胞摄取和亚细胞分布

3．3．16 pEP／PEI-DMAEA／DNA复合物介导的体外基因转染

3．4 本章小结

第四章 聚赖氨酸苄酯用于基因输送的研究

4．1 引言

4．2 实验方法

4．2．1 聚赖氨酸苄酯的合成

4．2．2 聚赖氨酸苄酯在不同pH缓冲溶液中的水解

4．2．3 细胞毒性实验

4．2．4 pLLB／DNA纳米复合物的制备

4．2．5 纳米复合物理化特性表征

4．2．6 DNA凝胶阻滞电泳和酶解实验

4．2．7 纳米复合物亚细胞分布实验

4．2．8 pLLB／DNA纳米复合物的体外基因转染

4．3 结果与讨论

4．3．1 聚赖氨酸苄酯的化学表征

4．3．2 聚赖氨酸苄酯在不同pH缓冲溶液中的水解曲线

4．3．3 聚赖氨酸苄酯的细胞毒性

4．3．4 pLLB／DNA纳米复合物的表征

4．3．5 pLLB-DNA的络合及对DNA的保护作用

4．3．6 pLLB／DNA纳米复合物的细胞摄取和亚细胞分布

4．3．7 pLLB／DNA纳米复合物的体外基因转染

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

作者简介