苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)odV-E25的分子生物学

摘要

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是首个完成测序的杆状病毒，被公认为是杆状病毒的模式种。在杆状病毒生活史中，存在两种表型具有明显差异、但遗传物质完全一致的病毒形态，即出芽型病毒(Buddedvirus，BV)和包涵体衍生型病毒(Occlusion-derived virus，ODV)。Odv-e25是ODV病毒主要的囊膜蛋白编码基因，也是杆状病毒37个核心基因之一，但至今功能未明。本研究旨在研究odv-e25在AcMNPV侵染过程中的作用。主要结论如下:
　　 1.AcMNPV odv-e25的表达与分布
　　 在所有杆状病毒基因组中都够鉴定到odv-e25同源序列，暗示odv-e25在杆状病毒侵染过程中发挥重要作用。5'RACE分析表明odv-e25转录起始于晚期转录元件ATAAG。病毒感染后12 h可检测到odv-e25转录产物，而感染后18h可检测到ODV-E25蛋白的表达，证明odv-e25为晚期基因。免疫荧光结果表明ODV-E25主要分布于感染细胞核的Ring-Zone区域。Western blotting结果显示ODV-E25是BV和ODV共有的结构蛋白。
　　 2.AcMNPV odv-e25功能分析
　　 通过构建缺失odv-e25的突变病毒验证odv-e25在杆状病毒侵染过程中的功能。结果表明敲除odv-e25影响病毒的复制，出芽型病毒(BV)的产量下降，病毒滴度明显降低。病毒基因组DNA复制试验表明odv-e25缺失后病毒DNA仍然可以完成复制。电镜分析表明敲除odv-e25不会影响核衣壳的形成，然而缺失odv-e25病毒不能产生核内微泡，进而影响核衣壳包膜成熟ODV的形成以及ODV包埋入多角体。
　　 3.ODV-E25表达水平对ODV的影响
　　 杆状病毒基因在感染过程中程序化表达，之前研究发现基因表达水平的上升或降低会影响病毒表型。为了研究odv-e25的表达水平对杆状病毒侵染的影响，构建了三个分别利用三个启动子表达odv-e25的重组病毒。这三个启动子分别为杆状病毒极早期基因-1(immediately early1，ie-1)启动子，odv-e25自身启动子以及极晚期基因多角体（polyhedrin，ph）启动子。Western blotting分析表明odv-e25在ie-1启动子下表达量最低，在自身启动子下的表达量次之，在多角体启动子下其表达量最高。病毒复制试验、BV的产量以及病毒感染力试验表明odv-e25在ie-1启动子或多角体启动子下表达都能在一定程度修复缺失odv-e25引起的缺陷。电子显微镜分析重组病毒转染后的细胞，发现在ie-1启动子表达odv-e25的病毒可以形成核内微泡，但是核衣壳不能被包膜形成正常的ODV。Odv-e25在多角体启动子以及自身启动子表达的重组病毒感染的细胞，不仅可以形成核内微泡，核衣壳被包膜形成ODV，而且ODV被正常包埋入多角体。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 杆状病毒分类

1．2 杆状病毒感染周期和基因表达

1．3 杆状病毒核心基因

1．4 杆状病毒病毒粒子相关蛋白的分类

1．5 λ-red重组系统

1．6 本研究目的意义

第二章 AcMNPV odv-e25的表达与分布

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 AcMNPV odv-e25功能分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 ODV-E25的表达水平影响ODV的形成

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

研究总结与工作展望

参考文献

附图

致谢

博士期间发表论文与专利