葡聚糖内切酶在转基因水稻种子中的表达及水稻种子中重组人血清白蛋白的纯化

摘要

转基因水稻种子作为表达药用蛋白和工业用酶的植物生物反应器，具有生产成本低、稳定性高、贮藏和运输方便、安全和易规模化等优点。建立与之配套适合规模化生产的下游纯化工艺，将使转基因水稻生物反应器在商业化进程中更具竞争力。
　　 以木质纤维素为原料的第二代生物燃料乙醇作为环境友好的新能源，日益引起全世界各国的关注。葡聚糖内切酶在纤维素乙醇工业中应用广泛，利用水稻作为生物反应器生产纤维素酶具有廉价、耐贮存等优点，对降低纤维素转变为葡萄糖的成本具有重大经济意义。将来源于嗜酸耐热纤维素分解菌（Acidothermuscellulolyticus）的β-葡聚糖内切酶基因（gb:U33212）经过水稻偏爱密码子优化后与水稻种子储藏蛋白Gt1启动子连接，克隆进pCAMBIA-1300双元载体中。采用农杆菌侵染法转化粳稻秀水110，获得了表达葡聚糖内切酶的转基因水稻植株。对获得的转化植株进行了PCR鉴定，结果显示葡聚糖内切酶基因已经整合进水稻染色体。以CMC-Na为底物对所得36个独立的T0代转基因株系种子测定酶活，其中株系C19的种子酶活最高约为830 unit/g。水稻种子中表达的葡聚糖内切酶最适pH值为5.0，最适温度为80℃，表明该酶与原宿主菌中的葡聚糖内切酶具有相同的酶学特性。实验结果表明葡聚糖内切酶基因能够在转基因水稻的不同世代中稳定遗传表达，种子中葡聚糖内切酶活性也不会在储藏过程中降低。本研究证实了转基因水稻作为葡聚糖内切酶生物反应器的可行性，为进一步的产业化应用奠定了基础。
　　 人血清白蛋白广泛应用于药物载体、蛋白质类药物制剂的辅料、细胞培养基添加剂、细胞冷冻保护剂、医疗器械包埋剂、体外诊断等。因此有必要探索新的工艺路线以期解决高纯度和低成本的矛盾，从而满足巨大的市场需求。为实现转基因水稻种子中重组人血清白蛋白(recombinant human serum albumin，rHSA)的产业化开发，本研究通过大量层析介质筛选和条件优化，建立一种适合于大规模操作的从转基因水稻种子中提取重组人血清白蛋白的分离纯化流程。最终选择了在文献中尚未见报道的ANX FF阴离子交换和Butyl HP疏水树脂为主要层析填料，摸索出一条两步色谱与热处理、酸碱沉淀、超滤技术相结合提取水稻种子中rHSA的纯化路线。所建立rHSA的纯化工艺充分考虑了工业化生产的要求，流程操作简便，成本较为低廉，易于放大。ANX FF阴离子交换和Butyl HP疏水层析相结合的两步色谱法，具有选择性高、自动化程度高、更符合GMP要求等特点。色谱分离后所得洗脱液经超滤脱盐、浓缩后直接真空冷冻干燥即可获得高纯度的rHSA纯品。整个纯化周期只需2天，总回收率达到62.4％，便可获得纯度达到99％的纯品。MALDI-TOF质谱和N端测序结果显示水稻种子中的rHSA与血浆源人血清白蛋白pHSA在分子结构上相同。水稻源的rHSA供应不受限制且易实现产业化，更加符合绿色安全的市场发展趋势。

目录

声明

致谢

摘要

缩写表

1 文献综述

1．1 纤维素乙醇研究概况

1．1．1 纤维素乙醇的兴起

1．1．2 纤维素乙醇的生产工艺

1．1．3 纤维素乙醇的产业发展

1．2 纤维素酶研究概况

1．2．1 纤维素酶的来源及应用

1．2．2 纤维素酶的组成结构和降解机理

1．2．3 纤维素酶的研究进展

1．3 植物生物反应器的研究概况

1．3．1 植物生物反应器的类型

1．3．2 植物生物反应器面临的瓶颈和应对策略

1．3．3 植物生物反应器的安全控制问题

1．4 重组人血清白蛋白提取纯化研究概况

1．5 研究意义和技术路线

2 葡聚糖内切酶在转基因水稻种子中的表达

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 分子生物学实验方法

2．1．3 水稻转基因组培实验方法

2．1．4 转葡聚糖内切酶水稻的农艺性状分析及种子酶活测定

2．2 结果与分析

2．2．1 植物表达载体的构建与鉴定

2．2．2 大肠杆菌原核表达的葡聚糖内切酶鉴定

2．2．3 转葡聚糖内切酶基因植株的获得及筛选

2．2．4 转葡聚糖内切酶水稻的草甘膦抗性检测

2．2．5 转葡聚糖内切酶水稻的性状分析

2．2．6 转葡聚糖内切酶水稻的分子鉴定

2．2．7 转基因水稻种子中葡聚糖内切酶活性测定

2．3 小结与讨论

3 水稻种子中重组人血清白蛋白的提取纯化

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 重组人血清白蛋白提取条件的确立

3．2．2 重组人血清白蛋白的粗分离

3．2．3 两步色谱层析

3．2．4 重组人血清白蛋白的纯度分析

3．2．5 重组人血清白蛋白的一二级结构的确定

3．3 小结与讨论

4 总讨论

4．1 创新之处

4．2 研究中存在的问题

4．3 展望

附录 Ⅰ 分子生物学实验用试剂配方

附录 Ⅱ 水稻转化培养基及溶液配方

附录 Ⅲ 仪器

参考文献