巯基微球协助含二硫键蛋白质体外复性研究

摘要

对于包涵体蛋白的体外重折叠，如何减少聚集体产生和实现二硫键正确配对是复性过程中亟待解决的两个问题。本文以溶菌酶和重组γ-猪肝酯酶(γ-PLE)为研究对象，向复性体系中添加巯基微球(SG-DTT)，该折叠助剂与蛋白分子间通过巯基/二硫键交换反应促进二硫键的正确配对，同时使蛋白分子可逆结合于微球表面以阻止分子间的聚集作用，从而提高折叠效率。 首先，通过两步无皂乳液聚合法合成苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚微球(SG)，并与DTT反应制得巯基负载量不同(分别为4.3μmol/g、15.1μmol/g和79.7μmol/g)的三种SG-DTT微球，以溶菌酶为模型蛋白考察其协助复性效果。结果表明，巯基微球能有效提高复性收率，蛋白浓度为1000μg/mL时，溶菌酶活性收率从未加微球的58％提高到84％。当GSSG浓度为0.5mM时，巯基负载量较高的微球协助复性效果更好，复性条件为微球与溶菌酶浓度比0.5、复性温度15℃和尿素浓度2.5 M。多批次复性实验证明该巯基微球可回收循环利用。 其次，通过大肠杆菌发酵制备得到了重组γ-PLE包涵体。破胞离心后，每升发酵液可获得粗制包涵体2.0 g，经洗涤和溶解，γ-PLE纯度达到80％。采用稀释复性，去折叠γ-PLE逐渐折叠成天然结构，氧化还原环境对复性效果具有重要影响。适合γ-PLE复性的GSSG浓度随着蛋白浓度升高而增加，还原态GSH和氧化态GSSG的比例在2～4时γ-PLE可达到较高的复性收率，γ-PLE复性时对氧化还原环境的要求要低于含4对二硫键的溶菌酶。 最后，在稀释复性的基础上，将巯基负载量不同(分别为6.1μmol/g、25.2μmol/g和143.4μmol/g)的三种SG-DTT微球用于协助γ-PLE体外复性。巯基负载量较高的微球协助复性效果较好，当其加入量为0.5 mg/mL时，复性后γ-PLE活性达到1187 U/L(蛋白浓度500μg/mL)和1885 U/L(蛋白浓度1000μg/mL)，比未加微球对照组的活性分别提高了81％和72％，且优于GSH协助复性效果，复性条件为pH9.5、复性温度15℃和尿素浓度1M。 研究表明，巯基微球在含二硫键蛋白质复性过程中能有效促进二硫键的正确配对，且复性后易分离回收，是一种新型高效复性添加剂，具有广阔的应用前景。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 蛋白质体外复性研究

1．2．1 包涵体的形成

1．2．2 包涵体的分离和溶解

1．2．3 蛋白质复性机制

1．3 蛋白质二硫键的形成

1．3．1 二硫键的形成机制

1．3．2 体外复性过程中二硫键的形成及常用氧化还原体系

1．4 蛋白质体外复性方法

1．4．1 稀释和透析复性

1．4．2 层析复性

1．4．3 分子伴侣和折叠酶介导复性

1．4．4 折叠助剂协助复性

1．5 功能性高聚物在协助蛋白质体外复性中的应用

1．5．1 温敏型水凝胶PNIPAM

1．5．2 带电荷的多聚物

1．5．3 巯基微球

1．6 本文研究思路及内容

1．6．1 溶菌酶

1．6．2 猪肝酯酶

1．6．3 研究思路

第二章 巯基微球的制备及其协助溶菌酶复性研究

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 巯基微球SG-DTT的制备

2．3．2 巯基微球SG-DTT的粒径及微球表面形态表征

2．3．3 SG-DTT微球巯基负载量的测定

2．3．4 溶菌酶的变性和复性

2．3．5 溶菌酶酶活测定

2．3．6 溶菌酶结构分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 巯基微球SG-DTT的制备及表征

2．4．2 氧化还原环境(GSSG／GSH浓度)及蛋白浓度对溶菌酶复性的影响

2．4．3 巯基微球SG-DTT协助溶菌酶复性

2．4．4 复性溶菌酶的荧光光谱分析

2．5 本章小结

第三章 重组γ-猪肝酯酶包涵体的制备及稀释复性

3．1 引言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 重组γ-PLE的发酵生产

3．3．2 重组γ-PLE包涵体的分离及洗涤纯化

3．3．3 重组γ-PLE包涵体的溶解变性和稀释复性

3．4 分析方法

3．4．1 还原性SDS-PAGE

3．4．2 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

3．4．3 猪肝酯酶活性测定

3．5 结果与讨论

3．5．1 重组γ-PLE的发酵培养

3．5．2 重组γ-PLE包涵体的分离纯化和溶解

3．5．3 重组γ-PLE的稀释复性

3．5．4 重组γ-PLE复性的适宜氧化还原环境(GSSG／GSH浓度)

3．6 本章小结

第四章 巯基微球协助重组γ-猪肝酯酶包涵体体外复性

4．1 引言

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 巯基徽球SG-DTT的制备及表征

4．3．2 重组γ-PLE包涵体的制备纯化及溶解变性

4．3．3 巯基微球SG-DTT协助重组γ-PLE包涵体复性

4．3．4 重组γ-PLE的活性测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 巯基微球SG-DTT的制备及表征

4．4．2 巯基微球SG-DTT协助γ-PLE包涵体复性

4．4．3 pH对SG-DTT微球协助γ-PLE复性的影响

4．4．4 温度对SG-DTT微球协助γ-PLE复性的影响

4．4．5 尿素浓度对SG-DTT微球协助γ-PLE复性的影响

4．4．6 巯基微球SG-DTT协助复性机理

4．5 本章小结

第五章 结论与建议

5．1 结论

5．2 建议

参考文献

作者简介