两性离子化合物对脂肪酶活性和稳定性影响的研究

摘要

本文考察了磺酸甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)对脂肪酶的活性、稳定性和构象变化的影响，以探索两性离子化合物对酶的作用。 酶液中添加不同浓度的SBMA。微量(0.1mM)或者高浓度(1M)的SBMA分别可使酶活性提高25.0％、99.2％。脂肪酶的稳定性也得到明显改善。在37℃下保温96h后，游离酶液混浊，相对活性为0.310，而含1M SBMA的酶液保持澄清，相对活性为1.350。在60℃下保温1h，游离酶液的相对活性仅剩0.154，而含1M SBMA的脂肪酶液相对活性为1.133。说明两性离子有利于维持酶分子天然构象。 N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)修饰酶的氨基完成乙烯基化，然后加入SBMA单体，在引发剂作用下进行氧化还原聚合，获得修饰酶。脂肪酶的氨基修饰度为94.5％。修饰酶具有温度敏感性，在50℃下易从溶液中析出，60℃以上才完全溶于水。修饰酶最适反应温度是55℃，此时游离酶的相对活性为0.276，而修饰酶为1.397。游离酶在pH=3、pH=7.5和pH=10.9下相对活性分别为0.542、1.000和0.433，而修饰酶的相对活性分别对应为0.838、1.397和0.633。紫外光谱显示，在高温、酸性、碱性下，脂肪酶的构象发生了变化。荧光光谱显示，SBMA聚合物的修饰并没有明显改变脂肪酶的天然构象。 包埋酶的制备:在乙烯基化脂肪酶液中加入适量的SBMA单体和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺交联剂，加入引发剂引发聚合反应，获得包埋酶。当SBMA单体质量为6g，交联剂占单体质量7％时，包埋酶获得最高的活性收率。在正庚烷中，包埋酶的最佳反应温度是40℃。适量的水有利于提高脂肪酶的活性，在含水量为2％时，包埋酶的平衡转化率最高，24h时转化率达到93.7％;在6h时的活性是游离酶最高活性的2.29倍。增加底物浓度会延长反应时间，降低平衡转化率。月桂酸浓度从40mM增加到200mM，包埋酶催化的酯化转化率从93.1％降低到86.4％;而游离的酶粉从91.6％降低到53.6％。说明底物浓度升高，对包埋酶催化更有利。包埋酶有良好的重复使用性，使用6次后依然保留了77.9％的初始活性。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

2 文献综述

2．1 SBMA两性离子化合物

2．1．1 两性离子化合物简介

2．1．2 SBMA简介

2．1．3 SBMA聚合物性质简介

2．2 两性离子化合物与酶蛋白的相互作用

2．2．1 两性离子有利于维持蛋白质天然构象

2．2．2 甜菜碱结构有利于酶分子稳定

2．2．3 两性离子聚合物对酶的影响

2．2．4 两性离子化合物对酶分子调节作用的研究现状和前景

2．3 酶的修饰和包埋

2．3．1 脂肪酶简介

2．3．2 酶的化学修饰

2．3．3 酶的包埋

2．4 本文研究内容

3 SBMA对酶催化活性的影响

3．1 前言

3．2 试剂与设备

3．2．1 脂肪酶酶液的配制

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验设备

3．3 实验方法

3．3．1 蛋白质含量测定方法——考马斯亮蓝染色法(Bradford)

3．3．2 月桂酸浓度测定方法——铜皂比色法

3．3．3 脂肪酶催化活性测定

3．3．4 SBMA对脂肪酶催化活性的影响

3．3．5 SBMA对脂肪酶稳定性的影响

3．3．6 SBMA对酶蛋白质聚集沉淀的影响

3．3．7 温度对脂肪酶催化活性的影响

3．3．8 不同离子类型化合物和PEG对脂肪酶催化活性的影响

3．4 结果与讨论

3．4．1 SBMA对脂肪酶催化活性的影响

3．4．2 SBMA对脂肪酶稳定性的影响

3．4．3 SBMA对脂肪酶聚集沉淀的影响

3．4．4 温度对脂肪酶催化活性的影响

3．4．5 不同离子类型化合物和PEG对脂肪酶催化活性的影响

3．5 小结

4 SBMA修饰脂肪酶及其催化性能

4．1 前言

4．2 材料与设备

4．2．1 主要材料

4．2．2 仪器设备

4．3 实验方法

4．3．1 脂肪酶乙烯基化修饰度的测定

4．3．2 SBMA修饰酶的制备

4．3．3 红外光谱扫描

4．3．4 荧光光谱扫描

4．3．5 水溶性的检测

4．3．6 温度对修饰酶催化活性的影响

4．3．7 pH对修饰酶催化活性的影响

4．3．8 游离酶与修饰酶的米氏常数

4．3．9 紫外光谱扫描

4．4 结果与讨论

4．4．1 脂肪酶乙烯基化修饰度的测定

4．4．2 红外光谱考察

4．4．3 脂肪酶与修饰酶的荧光光谱

4．4．4 修饰酶的水溶性质

4．4．5 温度对修饰酶催化活性的影响

4．4．6 pH对修饰酶催化活性的影响

4．4．7 游离酶与修饰酶的表观米氏常数

4．4．8 温度对脂肪酶紫外光谱的影响

4．4．9 pH值对脂肪酶紫外光谱的影响

4．4．10 温度对脂肪酶荧光光谱的影响

4．5 小结

5 SBMA包埋脂肪酶的制备及其有机相催化能力研究

5．1 前言

5．2 材料与设备

5．2．1 主要试剂

5．2．2 仪器设备

5．3 实验方法

5．3．1 包埋酶制备

5．3．2 水溶液中包埋酶催化活性测定

5．3．3 有机相中脂肪酶催化酯化反应活性测定

5．3．4 有机相包埋酶催化酯化反应活性测定

5．3．5 反应温度对有机相酶催化酯化反应的影响

5．3．6 含水量对有机相酶催化酯化反应的影响

5．3．7 底物浓度对有机相酶催化酯化反应的影响

5．3．8 有机相中包埋酶的重复使用性

5．4 结果与讨论

5．4．1 包埋过程单体用量考察

5．4．2 包埋过程交联剂用量考察

5．4．3 反应温度对有机相酶催化酯化反应的影响

5．4．4 含水量的对有机相酶催化酯化反应的影响

5．4．5 底物浓度对有机相酶催化酯化反应的影响

5．4．6 有机相中包埋酶的重复使用性

5．5 小结

6 结论与建议

6．1 结论

6．2 建议

参考文献

作者简介及在学期间所获得的科研成果