细胞自噬通过降解中心体微卫星处的OFD1促进原纤毛的形成

摘要

原纤毛是真核生物中普遍存在的类似于“天线”结构的细胞器，它能传导多种胞外信号，以保证生物体的正常发育并维持机体内稳态。导致原纤毛异常的突变，会影响生物体内多条信号转导通路，并引发人类多种遗传性疾病，统称为“纤毛病变性疾病”。很多与原纤毛形成相关的重要中心体蛋白和原纤毛蛋白的缺失及突变，或者上述蛋白在细胞内的错定位都会导致原纤毛结构或功能的异常。然而迄今为止，人们对于原纤毛形成分子机制的认识还极为有限。为了更为深入地研究原纤毛的形成机理以及细胞自噬途径的生理作用，开展了本文的研究，现将研究思路及实验结果总结如下:
　　(1)为了寻找细胞自噬途径的新底物以及潜在的接头蛋白，我们选用了最为可靠和普遍存在于哺乳动物体内的细胞自噬分子标记LC3为诱饵蛋白，利用串联亲和纯化技术分离得到包括PCM1，OFD1，Cep131在内的多个中心体微卫星蛋白，其中，PCM1与LC3及其同源物的结合相对稳定;
　　(2)利用免疫共沉淀方法证实了PCM1，OFD1和LC3在细胞内形成同一个蛋白复合体，其中PCM1是OFD1定位于中心体微卫星所必需的调节蛋白，并介导了OFD1和LC3的相互结合;
　　(3)在上述中心体微卫星蛋白中，OFD1是细胞自噬的新底物，在血清饥饿诱导的条件下被细胞自噬途径特异性降解;
　　(4)血清饥饿处理诱导中心体微卫星分子标记PCM1与LC3的共定位，并激活细胞自噬途径专一性降解定位于中心体微卫星处的OFD1;
　　(5)相对于定位在中心粒远端的OFD1，位于中心体微卫星处的OFD1的降解率更快;
　　(6)与Atg5-/-小鼠胚胎纤维元细胞相比，Atg5+/+小鼠胚胎纤维元细胞能够形成更多更长的原纤毛，并伴随着BBS4向原纤毛内的高效运输。Atg3-/-小鼠胚胎纤维元细胞与CQ处理的Atg5+/+小鼠胚胎纤维元细胞也表现出类似的纤毛形成缺陷，说明细胞自噬促进原纤毛形成，而中心体微卫星处OFD1的积累是导致原纤毛形成受阻的原因;
　　(7)利用shRNA介导的OFD1基因沉默更为高效地靶向定位位于中心体微卫星处的OFD1，提高小鼠胚胎纤维元细胞形成原纤毛的能力，并促使人类乳腺癌细胞系MCF7恢复形成原纤毛的能力，再度证实定位于中心体微卫星处的OFD1是原纤毛形成的通用抑制因子。
　　综上所述，本研究表明，细胞自噬通过特异性降解定位于中心体微卫星处的OFD1促进原纤毛在小鼠胚胎纤维元细胞以及人类乳腺癌细胞中的形成;首次证明细胞自噬途径在细胞器形成过程中的重要作用，也为治疗纤毛病变性疾病药物以及抗肿瘤药物的研发提供了重要的分子生化基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 细胞自噬概述

1．1 细胞自噬的定义及其生理功能

1．2 细胞自噬的分类

2 细胞自噬的调控

3 细胞自噬的分子机制

3．1 细胞自噬的发生及自噬体的形成

3．2 自噬体的延伸

3．3 自噬体的成熟及自噬—溶酶体的融合

3．4 细胞自噬对底物的选择性降解

4 细胞自噬领域中有待研究的重要问题

5 原纤毛

5．1 原纤毛的结构

5．2 原纤毛形成的分子机制

5．3 原纤毛形成的调控因子

6 原纤毛介导的信号通路

6．1 Hh信号通路

6．2 Wnt信号通路

6．3 PDGF信号通路

6．4 Hippo信号通路

7 原纤毛与疾病的关系

7．1 原纤毛病变性疾病

7．2 原纤毛与癌症

8 原纤毛领域中有待研究的重要问题

第二章 细胞自噬途径新底物OFD1的发现

1 实验材料

1．1 细胞系

1．2 载体

1．3 抗体

1．4 试剂

2 实验方法

2．1 细胞培养和继代

2．2 细胞转染

2．3 细胞收集及裂解

2．4 Western Blotting

2．5 可诱导型稳定表达靶蛋白的哺乳动物细胞系的建立

2．6 串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification)

2．7 银染

2．8 免疫共沉淀

2．9 细胞自噬的调控及活性检测

2．10 定量—PCR

2．11 免疫荧光检测和激光共聚焦显徼镜的使用

3 实验结果

3．1 细胞自噬分子标记LC3与多个中心体徼卫星蛋白互作

3．2 血清饥饿激活细胞自噬途径并降解OFD1

3．3 细胞自噬途径特异性降解定位于中心体微卫星处的OFD1

第三章 细胞自噬促进原纤毛的形成

1 实验材料

1．1 细胞系

1．2 载体

1．3 抗体

1．4 试剂

2 实验方法

2．1 细胞周期检测

2．2 诱导细胞形成原纤毛

2．3 构建稳定shRNA干扰细胞系

3 实验结果

3．1 细胞自噬通过降解中心体徽卫星处的OFD1促进原纤毛的形成

3．2 shRNA介导的基因沉默有效降低OFD1在中心体徼卫星处的表达，并促进原纤毛的形成

第四章 特异性降低OFD1在中心体徼卫星处的表达量促使乳腺癌细胞系MCF7重建原纤毛

1 实验材料

1．1 细胞系

1．2 抗体

2 实验方法

2．1 构建稳定shRNA干扰细胞系

2．2 扫描电镜样品制备及观察

3 实验结果

3．1 MCF7细胞shRNA介导的OFD1基因沉默细胞系的构建及鉴定

3．2 MCF7细胞shRNA介导的OFD1基因沉默细胞系能够重建原纤毛

第五章 总结和展望

1 研究结果

2 展望

2．1 探索重建原纤毛对癌细胞的影响

2．2 探索细胞自噬对纤毛病交性疾病的调节

2．3 探索定位于中心体徼卫星处OFD1抑制原纤毛形成的分子机制

2．4 探索细胞自噬对于OFD1及原纤毛形成调控的分子机制

2．5 探索原纤毛对细胞自噬途径的调节作用

参考文献

缩略词表

攻读学位期间的科研成果

致谢