微囊化卵巢细胞的雌二醇和孕酮释放研究

摘要

妇女的卵巢功能在进入更年期后逐渐衰退，雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌水平下降，导致更年期综合症。临床上常用激素替代疗法（HRT）来缓解患者的症状，但是，该疗法频繁地用药给患者带来了经济负担，长期的HRT治疗还可能引起严重的副作用。本文研究卵巢细胞的微囊化与异体移植后体内E2和P4的释放，主要包括四部分: (1)以海藻酸钠和壳聚糖为材料，使用静电液滴发生法制备海藻酸-壳聚糖-海藻酸(ACA)微囊。通过改变静电液滴发生装置的针头内径、电极距离、电压和注射流速，摸索控制海藻酸钙凝胶微球直径的方法;以微囊膨胀率(Sw)作为机械强度的评价指标，研究壳聚糖浓度和交联反应时间对ACA微囊机械强度的影响;比较不同壳聚糖浓度制备的ACA囊膜的牛血清白蛋白(BSA)和γ-球蛋白的透过性能。结果显示，使用较小的针头内径，缩短电极距离，提高电压和降低注射流速，可以制备直径较小的海藻酸钙凝胶微球;ACA微囊的Sw在10分钟内随交联反应时间延长而降低，之后不再发生显著变化;1.2％(w/v)壳聚糖溶液制备的ACA微囊具有较高的机械强度和较弱的BSA渗透性能;0.6％和0.3％(w/v)壳聚糖溶液制备的ACA微囊的机械强度和BSA渗透性能均无显著差异;三种浓度壳聚糖溶液制备的ACA囊膜对γ-球蛋白的阻隔能力无显著差异。 (2)以非洲爪蟾作动物模型，研究ACA微囊化卵巢细胞异体移植后的E2和P4分泌能力。用免疫组化法检测原代培养非洲爪蟾卵巢组织细胞的卵泡刺激素受体(FSHR)和黄体生成素受体(LHR);用孕马血清激素(PMSG)处理原代培养细胞48小时，酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液E2和P4浓度;用1.2％，0.6％和0.3％(w/v)壳聚糖溶液分别制备3组卵巢细胞ACA微囊，在培养28天内用CFDA-SE/PI处理并测算细胞成活率，检测培养60天内0.3％(w/v)壳聚糖组的培养液E2和P4浓度;将0.3％(w/v)壳聚糖溶液制备的卵巢细胞ACA微囊移植入去势雌性非洲爪蟾腹腔，ELISA法检测60天内血清的E2和P4水平。结果显示，原代非洲爪蟾卵巢细胞的FSHR和LHR免疫染色呈阳性，在20 IU/mL的PMSG处理时，培养细胞的E2和P4分泌水平最高;制备ACA微囊的最适壳聚糖浓度为0.3％(w/v);在体外培养条件下，ACA微囊化卵巢细胞保持60天的E2和P4分泌，并在移植后60天内显著提高了去势雌性非洲爪蟾血清E2和P4水平;移植后回收的微囊约90％保持完整和光滑。 (3)大鼠卵泡颗粒细胞(GCs)和卵泡膜细胞(TCs)的共微囊化。用免疫组化法分别检测原代培养大鼠GCs和TCs的FSHR、LHR和CYP17A1;将GCs和TCs依不同数量比例混合并ACA微囊化，培养48小时后，检测培养液E2和P4浓度;将GCs和TCs数量比例为1∶2的GCs/TCs微囊移植入去势雌性大鼠腹腔，检测60天内血清E2和P4水平。结果显示，GCs/TCs共微囊化显著提高了E2分泌水平，GCs/TCs数量比例为1∶2时E2分泌水平最高，在移植后60天内将去势大鼠血清E2和P4维持在正常水平;移植后回收的微囊约90％保持完整和光滑。 (4)建立模拟卵泡自然结构的卵巢细胞微囊化模式。微载体培养大鼠GCs(GCsMs)，分别制备包有GCs、GCs+TCs、GCsMs和GCsMs+TCs的ACA微囊并体外培养，WST-1法检测微囊化GCs和GCsMs在培养24小时内的生理活性;培养48小时后，检测培养液E2和P4浓度;将模拟卵泡（GCsMs+TCs微囊）移植入去势雌性大鼠腹腔，检测60天内血清E2和P4水平。结果显示，微囊化GCsMs的生理活性显著高于微囊化GCs;与其它三种微囊相比，模拟卵泡的E2分泌水平最高，移植后60天内将去势大鼠血清E2和P4维持在正常水平;移植后回收的微囊约90％保持完整和光滑。 综上所述，本文以海藻酸钠和壳聚糖为囊材，用静电液滴发生法制备了卵巢细胞的ACA微囊，并分别在非洲爪蟾和大鼠上进行了同种异体移植实验，发现非洲爪蟾卵巢细胞微囊、大鼠GCs/TCs微囊，以及模拟卵泡在体外培养条件下都具有雌性激素分泌功能，移植后60天内能够持续释放E2和P4，为妇女更年期综合症的治疗开拓了新思路。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 雌激素替代疗法

1．2 卵巢器官和组织的移植

1．3 组织细胞的微囊化和移植

1．3．1 细胞微囊的性能要求

1．3．2 微囊化细胞研究现状

1．3．3 海藻酸-壳聚糖-海藻酸(ACA)微囊

1．3．4 静电液滴发生法

1．4 本文的内容和意义

2 ACA微囊制备条件的研究

2．1 前言

2．2 仪器与试剂

2．2．1 仪器

2．2．2 试剂

2．3 实验方法

2．3．1 主要溶液配制

2．3．2 静电液滴发生法制备ACA微囊

2．3．3 海藻酸钙凝胶微球直径测定

2．3．4 ACA微囊的膨胀率(Sw)测定

2．3．5 ACA微囊在BSA溶液中孵育

2．3．6 ACA微囊在γ-球蛋白溶液中孵育

2．3．7 统计学分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 静电液滴发生法影响海藻酸钙凝胶微球直径的因素

2．4．2 交联反应时间和壳聚糖溶液浓度对ACA微囊膨胀率(Sw)的影响

2．4．3 ACA微囊的BSA透过性

2．4．4 ACA微囊对γ-球蛋白的阻隔能力

2．5 本章小结

3 ACA微囊化非洲爪蟾卵巢细胞和移植

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 实验动物

3．2．2 仪器

3．2．3 试剂

3．3 实验方法

3．3．1 主要溶液配制

3．3．2 雌性非洲爪蟾的去势

3．3．3 卵巢细胞的原代培养

3．3．4 PMSG处理原代培养非洲爪蟾卵巢细胞

3．3．5 原代非洲爪蟾卵巢细胞免疫组化染色

3．3．6 非洲爪蟾卵巢细胞的ACA微囊化和体外培养

3．3．7 体外培养ACA微囊化细胞的成活率检测

3．3．8 微囊化非洲爪蟾卵巢细胞WST-1检测

3．3．9 ACA微囊化非洲爪蟾卵巢细胞移植

3．3．10 非洲爪蟾血清样本的收集

3．3．11 ELISA法检测样本E2和P4浓度

3．3．12 移植微囊的回收和CFDA-SE处理

3．3．13 统计学分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 原代非洲爪蟾卵巢细胞形态观察

3．4．2 原代非洲爪蟾卵巢细胞鉴定

3．4．3 PMSG对非洲爪蟾卵巢细胞E2和P4分泌的影响

3．4．4 制备ACA微囊的壳聚糖浓度对非洲爪蟾卵巢细胞成活率的影响

3．4．5 非洲爪蟾卵巢细胞ACA微囊化后的生理活性变化

3．4．6 ACA微囊化非洲爪蟾卵巢细胞的体外E2和P4分泌能力

3．4．7 ACA微囊化非洲爪蟾卵巢细胞移植后的E2分泌

3．4．8 ACA微囊化非洲爪蟾卵巢细胞移植后的P4分泌

3．4．9 移植后回收的细胞微囊

3．5 本章小结

4 共微囊化大鼠GCs／TCs的E2和P4体内释放

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 实验动物

4．2．2 仪器

4．2．3 试剂

4．3 实验方法

4．3．1 主要溶液配制

4．3．2 大鼠GCs的原代培养

4．3．3 大鼠TCs的原代培养

4．3．4 大鼠GCs和TCs生长曲线制作

4．3．5 大鼠GCs和TCs免疫组化染色

4．3．6 大鼠GCs和TCs的共微囊化

4．3．7 GCs／TCs微囊的CFDA-SE处理

4．3．8 雌性大鼠去势

4．3．9 大鼠实验分组和细胞微囊移植

4．3．10 大鼠采血和血清样本制备

4．3．11 血清E2和P4水平检测

4．3．12 移植微囊的回收和CFDA-SE处理

4．3．13 统计学分析

4．4 结果和讨论

4．4．1 原代大鼠GCs和TCs的形态观察

4．4．2 原代大鼠GCs和TCs的鉴定

4．4．3 GCs／TCs微囊的形态

4．4．4 微囊内GCs和TCs数量比例对E2分泌的影响

4．4．5 微囊内GCs和TCs数量比例对P4分泌的影响

4．4．6 GCs／TCs微囊的异体移植对去势雌性大鼠E2分泌水平的影响

4．4．7 GCs／TCs微囊的异体移植对去势雌性大鼠P4分泌水平的影响

4．4．8 移植后回收的细胞微囊

4．5 本章小结

5 模拟卵泡自然结构的大鼠GCs和TCs微囊化模式

5．1 前言

5．2 实验材料

5．2．1 实验动物

5．2．2 仪器

5．2．3 试剂

5．3 实验方法

5．3．1 大鼠GCs和TCs的原代培养

5．3．2 玻璃器皿的硅化

5．3．3 大鼠GCs的微载体培养

5．3．4 微载体培养GCs的生长曲线制作

5．3．5 GCs、GCsMs、GCs+TCs和GCsMs+TCs微囊制备和体外培养

5．3．6 微囊化细胞的WST-1检测

5．3．7 大鼠实验分组和移植

5．3．8 ELISA法检测血清E2和P4水平

5．3．9 移植微囊的回收和CFDA-SE处理

5．3．10 统计学分析

5．4 结果与讨论

5．4．1 大鼠GCs的微载体生长

5．4．2 微载体培养对微囊化GCs生理活性的影响

5．4．3 微囊化细胞在体外培养条件下的E2和P4分泌水平

5．4．4 异体移植模拟卵泡对去势雌性大鼠E2和P4分泌水平的影响

5．4．5 移植后回收的模拟卵泡

5．5 本章小结

6 全文总结

参考文献

综述 细胞和组织的微囊化技术

作者简历及在学期间所取得的科研成果