菜蛾盘绒茧蜂病毒Ankyrin和PTP家族基因克隆、序列分析和一个Ankyrin基因启动子序列初步鉴定

摘要

在菜蛾盘绒茧蜂成功寄生小菜蛾的过程中，菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(CvBV)是起关键作用的主要寄生因子。在CvBV编码众多蛋白的基因家族中，蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)家族基因（PTP）和锚蛋白家族基因(Ankyrin)是成员数量最多的两个基因家族，并且寄生后基因的表达也非常快。Ankyrin被认为是主要的免疫抑制相关基因，在寄生蜂寄生寄主中参与了抑制寄主免疫反应中的信号传导，尤其是对寄主Toll信号途径的关键步骤中的NF-kB直接进行抑制。PTP由于其参与细胞内磷酸化水平的调控，能在信号途径的多个步骤中与寄主的PTP进行竞争性抑制。所以研究其基因结构，尤其是启动子，对于揭示PDV抑制寄主免疫的机理机制则显得尤为重要。
　　本文克隆了6个PTP基因和1个Ankyrin基因，并对其序列功能进行了初步研究;同时利用重构建含有萤火虫荧光素酶基因的载体转染HEK293细胞的方法，得到1条具有启动活性的启动子序列。现将结果总结如下:
　　1)采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了7条cDNA的全长序列，所克隆的7条cDNA的全长序列命名为CvBV-C2-2、CvBV-C12-2、CvB V-C12-5、CvB V-C12-11、CvBV-C14-5、CvB V-C4-6和CvBV-C28-1，长度分别为966bp、1130bp、1301bp、1245bp、1383bp、1177bp和1057bp，开放阅读框长度分别为492bp、900bp、894bp、948 bp、972bp、1005 bp和831bp，分别编码163、299、297、315、323、334和276个氨基酸，预测分子量分别为18867.54、34607.06、34514.32、36583.69、36583.69、39166.89和32001.44Daltons。序列翻译蛋白序列分析结果表明，CvBV-C2-2基因翻译Ankyrin蛋白，其它6个基因序列均翻译PTP蛋白。
　　2)利用重构建的含有萤火虫荧光素酶报告基因载体转染HEK293细胞的方法，得到Ankyrin基因家族的1条具有启动活性的启动子序列。结果显示，在验证的多个基因中，发现了一个基因的上游启动子序列启动报告基因，检测到了荧光值，为C17-4基因，且该基因C17-4P2和pGL3-Enhancer Vector重构建的载体样品与C17-4P3和pGL3-EnhancerVector重构建的载体样品中都有荧光值，且后者相对荧光强度明显弱于前者，而C17-4P1和pGL3-Enhancer Vector重构建的载体样品中则没有检测到数值。

目录

声明

论文说明

致谢

前言

摘要

第一章 文献综述及研究进展

1 小菜蛾和寄生蜂研究的意义

1．1 小菜蛾及其危害

1．2 寄生蜂及其生物防治的作用

2 寄生蜂对寄主的生理调控

2．1 寄生蜂对寄主的免疫抑制和发育调控策略

2．2 寄生蜂的三种主要寄生因子

3 多分DNA病毒(PDV)概述

3．1 多分DNA病毒(PDVs)

3．2 多分DNA病毒对寄主昆虫的作用

3．3 多分DNA病毒基因组、主要基因家族及其研究现状

4 Ankyrin基因和PTP基因家族的功能和研究进展

4．1 Ankyrin基因蛋白

4．2 蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)

5 CvBV中Ankyrin家族基因启动子及其研究进展

6 本实验研究的目的和意义

第二章 基本材料与方法

1 养虫设备

1．1 全自动人工气候室

1．2 智能人工气候箱

1．3 养虫笼

1．4 产卵笼

1．5 保蜂盒及寄生盒

1．6 吸虫管

2 供试材料

2．1 供试蔬菜

2．2 虫源

3 供试昆虫的人工饲养

3．1 小菜蛾的饲养

3．2 寄生蜂的饲养

4 实验仪器及软件系统

4．1 实验仪器

4．2 软件系统

5 常用实验试剂及配制

5．1 工具酶及试剂盒

5．2 其它试剂

5．3 一般试剂的配制

6 常规实验方法

6．1 PDV病毒颗粒的收集及其DNA的提取

6．2 小菜蛾幼虫PDV病毒RNA的提取

6．3 c第一链的合成

6．4 PCR反应

6．5 感受态细胞的制备

6．6 琼脂糖凝胶电泳

6．7 凝胶回收目的片段

6．8 连接反应

6．9 转化与活化

6．10 质粒提取

6．11 3'、5'末端快速扩增(RACE)

6．12 目的片段的双酶切

6．13 含报告基因的表达载体的重新构建

6．14 细胞传代培养

6．15 HEK-293细胞系转染

6．16 转染细胞后报告基因的检测

第三章 CvBV锚蛋白和蛋白酪氨酸磷酸酶基因的克隆及序列分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 菜蛾盘绒茧蜂寄生后小菜蛾血淋巴的收集

1．3 菜蛾盘绒茧蜂寄生后小菜蛾血淋巴RNA的提取及cDNA第—链的合成

1．4 引物设计

1．5 RACE

1．6 生物信息学分析

2 结果与分析

2．1 CvBV-C2-2全长cDNA及DNA序列分析

2．2 CvBV-C12-2全长cDNA及DNA序列分析

2．3 CvBV-C12-5全长cDNA及DNA序列分析

2．4 CvBV-C12-11全长cDNA及DNA序列分析

2．5 CvBV-C14-5全长cDNA及DNA序列分析

2．6 CvBV-C14-6全长cDNA及DNA序列分析

2．7 CvBV-C28-1全长cDNA及DNA序列分析

2．8 蛋白序列同源相似性分析

3 结论

第四章 CvBV中Ankyrin基因CvBV-C17-4启动子序列初步鉴定

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 供试细胞

1．3 菜蛾盘绒茧蜂病毒粒子的收集及其DNA的提取

1．4 基因启动子序列的引物设计

1．5 目的条带的克隆、产物纯化

1．6 目的启动子条带和pGL3 Vector载体进行表达载体重构建

1．7 重构建载体转染HEK293细胞

1．8 荧光素酶活性检测

2 结果与分析

2．1 测序结果得到的目的启动子条带结构分析

2．2 获得目的启动子条带及其与pGL3 Vector载体进行表达载体重构建

2．2 荧光素酶活性检测

3 讨论

第五章 总讨论

参考文献