阉割降低猪膻味性状的分子机制的初步研究

摘要

公猪膻味性状主要是由雄烯酮和粪臭素造成的。雄烯酮属固醇类，由睾丸间质细胞分泌后，经血液循环在唾液腺释放，发挥信号素的作用。粪臭素是在大肠中由微生物发酵分解色氨酸产生的，后经肠道吸收进入血液循环。雄烯酮和粪臭素两者均为亲脂性物质，在肝脏中代谢，未代谢的部分沉积在脂肪中，而导致猪肉带有异味。在生产中，常对公猪进行阉割来避免膻味性状的影响。
　　为研究阉割降低膻味性状的分子机制，我们选取阉割和非阉割金华猪和长大猪，采用高效液相色谱法检测了公猪皮下脂肪粪臭素含量，采用荧光定量PCR检测了阉割和非阉割组公猪肝脏中膻味性状代谢相关基因CYP2E1、SULT1A1、SULT2A1、FXR基因mRNA以及与其具有靶关系的miR-122和miR-378的表达水平，采用亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)检测了miR-148a和miR-378启动子区域甲基化情况。结果如下:
　　(1)证实了公猪皮下脂肪中粪臭素沉积水平存在品种差异。公猪进入青春期后，皮下脂肪中粪臭素水平随着日龄的增加而逐渐增加。阉割能显著降低粪臭素水平(P＜0.01)，但阉割后，粪臭素水平仍然随着日龄的增加而增加。
　　(2)证实了公猪膻味性状代谢相关基因表达存在品种差异。阉割后，金华猪肝脏中膻味性状代谢相关基因CYP2E1显著下调(P＜0.01)、SULT2A1显著上调(P＜0.01)，而阉割后大白猪肝脏中两基因表达趋势与金华猪相反。阉割能显著上调FXR基因的表达水平(P＜0.05)，大白猪肝脏SULT1A1基因显著下调(P＜0.05)，而金华猪有所下调，但差异不显著。这证实了膻味物质代谢水平可能取决于相关代谢酶的蛋白表达水平和酶活性，而与相关基因mRNA的表达水平不直接相关。
　　(3)阉割显著降低公猪肝脏miR-122和miR-378的表达水平(P＜0.01)。miR-122和miR-378可能处在膻味性状的调控网络中，阉割下调IGF1R的表达水平，可能进而通过IGF1R-PI3K/Akt-GSK-3β-C/EBPα-miR-122通路下调miR-122的表达水平。
　　(4)阉割对miR-148a启动子区域甲基化水平没有影响，但阉割能显著上调miR-378启动子区域甲基化水平，进而下调miR-378的表达水平。
　　由此我们推测，阉割通过甲基化、转录调控因子等相关调控因素影响miRNAs或相关基因mRNA的表达，进而直接或间接影响膻味性状代谢基因的表达，从而实现对膻味性状的调控作用，并且miRNAs在膻味性状的调控网络中可能发挥着重要的作用。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词

第1章 文献综述

1．1 膻味性状简介

1．1．1 雄烯酮

1．1．2 粪臭素

1．2 阉割在生猪生产中的应用

1．3 膻味性状的研究进展

1．3．1 影响膻味性状的遗传因素

1．3．2 膻味性状与性激素水平的关系

1．3．3 降低膻味性状的相关研究

1．4 表观遗传

1．4．1 表观遗传概述

1．4．2 MicroRNA研究概述

1．4．3 甲基化研究概述

1．5 调控网络

1．6 阉割降低膻味性状的可能机制

1．7 本研究的目的和意义

第2章 阉割对公猪皮下脂肪粪臭素含量的影响

2．1 实验材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器及试剂

2．1．3 实验方法

2．1．4 数据处理

2．2 结果和分析

2．2．1 不同生长阶段、不同猪种皮下脂肪粪臭素含量的差异

2．2．2 阉割对长大猪皮下脂肪粪臭素含量的影响

2．3 讨论

2．3．1 皮下脂肪粪臭素含量的品种差异

2．3．2 阉割对公猪皮下脂肪粪臭素含量的影响

第3章 阉割对膻味性状代谢基因表达量的影响

3．1 实验材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器及试剂

3．1．3 实验方法

3．1．4 数据分析

3．2 结果和分析

3．2．1 总RNA的提取与检测

3．2．2 荧光定量PCR标准曲线的建立

3．2．3 荧光定量PCR扩增曲线及溶解曲线

3．2．4 荧光定量PCR检测结果

3．3 讨论

3．3．1 阉割对膻味性状代谢相关基因表达量的影响

3．3．2 阉割影响膻味性状代谢相关基因表达调控的可能机制

第4章 阉割对公猪肝脏miR-122和miR-378表达水平的影响

4．1 实验材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器及试剂

4．1．3 实验方法

4．1．4 数据处理

4．2 结果和分析

4．2．1 MicroRNA序列获取

4．2．2 MicroRNA靶基因预测

4．2．3 MiRNA的提取与检测

4．2．4 荧光定量PCR扩增曲线及溶解曲线

4．2．5 阉割组和非阉割组荧光定量PCR检测结果

4．3 讨论

4．3．1 公猪肝脏miR-122和miR-378表达规律及阉割对其表达的影响

4．3．2 阉割影响公猪肝脏miR-122和miR-378表达量的可能机制

第5章 阉割对公猪肝脏miR-148a和miR-378启动子区域甲基化水平的影响

5．1 实验材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验仪器及试剂

5．1．3 实验方法

5．1．4 数据处理

5．2 结果和分析

5．2．1 DNA的提取与检测

5．2．2 PCR扩增产物电泳检测

5．2．3 阉割和非阉割组甲基化检测结果

5．3 讨论

5．3．1 阉割对肝脏miR-148a和miR-378启动子区域甲基化的影响

5．3．2 阉割影响肝脏miR-378启动子区域甲基化水平的可能机制

第6章 主要结论、创新点及研究展望

6．1 主要结论

6．2 阉割降低猪膻味性状的可能的分子机制

6．3 创新点

6．4 后续研究展望

参考文献

作者简历及在读期间所取得的科研成果

致谢