miR-429调控猪产仔性状的分子机制初步研究

摘要

猪的繁殖性状，尤其是产仔性状，是影响现代养猪业经济效益的重要因素之一。猪的繁殖过程主要依赖于垂体-下丘脑-性腺轴的调控，这个过程还受到许多基因与环境相互作用。近年来，关于猪的miRNA研究逐渐增多，但是对于猪繁殖性状的研究相对较少。通过文献报道和我们实验室已有的成果,我们发现miR-429、miR-143、miR-145对哺乳动物的繁殖性状可能有重要的调控作用；而且在雌性小鼠的垂体中已经证实miR-429可以通过下调E盒结合锌指蛋白1（E-box-binding homeobox1，ZEB1）基因的表达来上调促黄体生成素β(luteinizing hormone beta polypeptide，LHβ)基因的表达，从而影响雌鼠的排卵过程。由于miRNA在哺乳动物中具有高度的保守性，所以这些 miRNA的调控作用及分子机制可能在猪上也存在。
　　因此本试验通过荧光定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）、双荧光素酶报告基因、电泳迁移率（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）等实验技术，主要研究了miR-429和与miR-429调控相关的靶基因（ZEB1和LHβ）及miR-143-3p、miR-145-3p在大约克夏猪和皖南黑猪高、低产仔数母猪生殖轴组织（垂体、下丘脑、卵巢、子宫、输卵管）中的表达规律及miR-429、ZEB1和LHβ三者间的靶向调控关系，从而探究miR-429调控母猪产仔性状的分子机制。取得了下列结果：
　　1．miR-429和与miR-429调控相关的靶基因（ZEB1和 LHβ）、miR-143-3p、miR-145-3p等在母猪的生殖轴组织的表达规律：miR-429在母猪的垂体和输卵管中高表达, LHβ只在猪垂体中表达较高，ZEB1在猪生殖轴组织中广泛表达，miR-143-3p和miR-145-3p在子宫，卵巢，输卵管中表达较高。
　　2．miR-429和与 miR-429调控相关的靶基因（ZEB1和 LHβ）、miR-143-3p、miR-145-3p在大约克夏猪和皖南黑猪高、低产仔数母猪生殖轴组织的表达差异：在垂体中，miR-429、LHβ的表达量高产组均显著高于低产组，而ZEB1的表达量高产组均显著高于低产组；在子宫中miR-143-3p和miR-145-3p的表达量高产组均显著低于低产组。由结果可知：miR-429、miR-143-3p和miR-145-3p可能对猪的产仔性状产生影响；miR-429、ZEB1和LHβ三者之间可能存在靶向调控关系。
　　3．miR-429和ZEB1之间的靶向关系：通过在293T细胞中进行的双荧光素酶实验，我们发现转染 pmr-mcherry载体的实验组荧光值极显著高于转染pmr-mcherry-ssc-miR-429载体的实验组（P＜0.01）。说明ssc-miR-429在 ZEB1的3’UTR区域有结合位点，ssc-miR-429可能靶向调控ZEB1。
　　4.ZEB1和LHβ之间的靶向关系：根据EMSA结果，T1和T2的胶孔中均出现DNA探针与目的蛋白结合并迁移的条带，说明在猪中转录因子ZEB1能与LHβ基因的启动子区域发生互作，转录因子ZEB1和LHβ之间可能存在靶向关系。
　　综上所诉，miR-429、miR-143-3p和miR-145-3p可能影响母猪的产仔性状；而miR-429在猪的垂体中可能通过下调ZEB1基因的表达从而间接上调LHβ基因的表达，来调控母猪的产仔性能。

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文 献 综 述

1 miRNA调控哺乳动物生殖过程的研究进展

2 试验相材料和技术方法介绍

引言

1材料与方法

1.1 试验材料

1.2主要仪器和试验试剂

1.3 试验方法

2 结果与分析

2.1 总RNA的抽提与检测

2.2 荧光实时定量qPCR标准曲线和熔解曲线的分析

2.3 miR-429、ZEB1、LHβ、miR-143-3p和miR-145-3p在大约克夏猪和皖南黑猪母猪生殖轴组织中的表达规律

2.4 miR-429、ZEB1和LHβ在高、低产仔数母猪生殖轴组织中的表达差异

2.5 miR-143-3p、miR-145-3p在高、低产仔数母猪生殖轴组织中的表达差异

2.6 miR-429、转录因子ZEB1与靶基因结合位点的预测

2.7 双荧光素酶实验

2.8 EMSA实验

3 讨论

3.1 不同品种间miRNA表达的差异

3.2 miR-429对母猪产仔数的影响

3.3 miR-429调控母猪产仔数的分子机制

3.4 miR-145-3p对母猪产仔数的影响

4结论

参考文献

致谢

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