猪Casp8ap2基因SNP检测、产仔数性状关联及表达调控分析

摘要

猪是人类食用肉类的主要来源之一，提高猪的繁殖力是增加养猪业生产效益的重要途径，许多科学家致力于猪产仔数方面的研究。最常用方法是分子标记辅助选择，因为猪产仔数性状是限性遗传，且遗传力较为低下。我们的前期研究筛选出了包含Casp8ap2基因在内的一些中国太湖猪和大白猪排卵前卵泡差异表达基因。Caspase家族基因可能通过凋亡机制阻止妊娠期、胚胎发生、幼体期及精子形成等生理过程的分化异常。因此，我们以Casp8ap2基因为猪产仔数候选基因进行研究，取得了如下结果：
　　1.SNP检测及产仔数性状关联分析
　　(1)在猪Casp8ap2基因启动子区发现一个SNP位点，即g.-752A>G，建立该多态位点的PCR-StyI-RFLP检测技术。在通城猪和梅山猪中，A等位基因是优势基因；在农科院大白猪、中国瘦肉猪新品系DIV猪等8个猪种中，G等位基因是优势基因。在大白猪和第DIV系猪中进行g.-752A>G位点与产仔数性状关联分析，结果显示大白猪GG基因型的总胎次产活仔数显著高于AA型（P<0.05），但加性效应值并未达到显著水平。
　　(2)在猪Casp8ap2基因第二内含子区发现一个SNP位点，即g.105624-253T>C，建立该多态位点的PCR-NdeI-RFLP检测技术。在梅山猪和通城猪中，C等位基因是优势基因；在农科院大白猪、中国瘦肉猪新品系DIV猪等8个猪种中，T等位基因是优势基因。在大白猪和第DIV系猪中进行g.105624-253T>C位点与产仔数性状关联分析，结果显示所有数据差异均未达到显著水平。
　　(3)在猪Casp8ap2基因第二内含子区发现另一个SNP位点，即g.105624-91A>G，建立该多态位点的PCR-FokI-RFLP检测技术。在梅山猪和通城猪中，G等位基因是优势基因；在大白猪、中国瘦肉猪新品系DIV猪等8个猪种中，A等位基因是优势基因。在农科院大白猪和第DIV系猪中进行g.105624-91A>G位点与产仔数性状关联分析，结果显示所有数据差异均未达到显著水平。
　　2. Casp8ap2基因核心启动子区确定
　　利用生物信息学软件BDGP预测猪Casp8ap2基因启动子区1520bp序列得到4个潜在核心启动子区，并成功构建5个缺失片段（Del-1、Del-2、 Del-3、 Del-4、Del-5）的重组PGL-3报告载体。采用脂质体转染法，将这五个缺失片段表达载体与PGL3-Basic阴性对照组、PGL3-Control阳性对照组转染到CHO细胞系和Hela细胞系中，鉴定得出：核心启动子位于第四个预测的核心启动子区内(-310bp～-91bp)；另外，-1495bp～-1312bp和-1312bp～-725bp两个区域内可能存在负调控位点，-725bp～-310bp区域可能存在组织特异性调控位点，-310bp～-91bp区域可能存在正调控位点。
　　3.猪Casp8ap2核心启动子区转录因子研究
　　利用生物信息学软件 TFSEARCH分析猪Casp8ap2核心启动子区（-310bp～-91bp），预测出与猪繁殖性状有关的三个潜在转录因子Sox-5、Kr、C/EBPα结合位点。构建转录因子结合位点突变型pGL3重组载体并转染验证，C/EBPα还同时做超表达分析，双荧光素酶报告分析显示可能确实有相应转录因子通过转录因子Sox-5、Kr、C/EBPα结合位点作用于Casp8ap2基因。

目录

声明

第一章 文献综述

1 猪产仔数候选基因研究进展

2 Casp8ap2基因的研究进展

3 启动子

第二章 研究目的及意义

第三章 材料与方法

1.试验材料

2 试验方法

第四章 结果分析

1 猪总DNA提取及质量检测

2 猪Casp8ap2基因启动子区的克隆

3 猪Casp8ap2基因的多态性检测

4 Casp8ap2基因启动子区域研究

5 Casp8ap2启动子区转录因子研究

第五章 讨论

1 关于猪产仔数候选基因

2 关于猪Casp8ap2基因SNP的研究

3 关于猪Casp8ap2基因启动子区的研究

4 猪Casp8ap2基因转录调控分析

第六章 小结

1 本研究的主要结果及创新点

2 本研究不足之处及下一步研究计划

参考文献

附录

致谢