膜荚黄芪和大豆苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达

摘要

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine），作为人体必需的氨基酸之一，在食品工业中，主要用作新型食品添加剂阿斯巴甜（Aspartame，L-Asp-L-Phe-Me）的合成原料。随着世界市场每年对阿斯巴甜需求量的增加，L-Phe的合成工艺已成为当前生物化工领域研究与开发的热点。利用苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonia-lyase，PAL，E.C.4.3.1.5）的逆向催化特性来生产L-Phe是一条主要的路线，关键问题在于怎样低成本而又高效地获得苯丙氨酸解氨酶PAL。本研究在毕赤酵母GS115和大肠杆菌BL21中构建了PAL基因工程菌，期望通过微生物发酵实现苯丙氨酸解氨酶PAL的工业化生产。研究结果如下:
　　1)克隆到了来自膜英黄芪和大豆的PAL基因的ORF。
　　2)构建了克隆载体pUCm-T-PAL并转化到了大肠杆菌DH5α中。
　　3)PAL基因的生物信息学分析结果。
　　利用DNAStar软件和NCBI对测序序列进行分析，结果如下:来自于膜英黄芪的基因ORF长度为2157bp，编码718个氨基酸，蛋白相对分子质量为78KD，等电点为6.04，所扩增到的基因其核酸序列及氨基酸序列均与膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶EF567076.1有99％的一致性;来自于大豆的基因ORF长度为2142bp，编码713个氨基酸，蛋白相对分子质量为77.6KD，等电点为6.31，所扩增到的基因其核酸序列及氨基酸序列均与大豆苯丙氨酸解氨酶AK245610.1有100％的一致性。
　　4)利用体外同源重组技术构建了表达载体pPIC9K-AmPAL, pPIC9K-GmPAL和pET32a-AmPAL。
　　5)获得了基因工程菌GS115-pPIC9K-AmPAL，GS115-pPIC9K-GmPAL和BL21-pET32a-AmPAL。
　　基因工程菌诱导表达后，对其产物进行分析，结果如下:①重组菌BL21-pET32a-AmPAL与负对照相比，25℃时，1mmoL/L IPTG诱导1h后，其SDS-PAGE电泳图谱在96kD(包括载体上部分氨基酸序列)处有一条明显的特异性蛋白条带，大小与预期PAL蛋白一致，但是酶活性不高，只有5U;②重组菌GS115-pPIC9K-AmPAL，1％甲醇诱导48h后，其SDS-PAGE电泳图谱在78KD位置处出现一条特异性条带，其大小与预期值一致，并且随着诱导时间增加，PAL表达量越来越大，诱导120h后，表达量达到最大。利用Q-Sepharose FF蛋白纯化柱对总蛋白进行纯化，获得了较纯的苯丙氨酸解氨酶PAL。Bradford法测得纯化后PAL质量浓度为0.08mg/mL，含量占总蛋白的11.54％，最高比活达到4270U/mg。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 苯丙氨酸解氨酶的发现

1．2 苯丙氨酸解氨酶研究进展

1．2．1 PAL分布与定位

1．2．2 PAL的酶学性质

1．2．3 PAL基因

1．2．4 PAL对植物生理代谢的意义

1．2．5 PAL的应用价值

1．2．6 PAL的生产方法

1．2．7 体外载体构建技术

1．3 课题研究的内容和意义

2 苯丙氨酸解氨酶PAL的基因克隆与生物信息学分析

2．1 材料

2．1．1 种子

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 工具酶

2．1．4 培养基与常用溶液

2．2 方法

2．2．1 实验材料的准备

2．2．2 总RNA的提取

2．2．3 反转录反应

2．2．4 目的基因PAL的PCR扩增

2．2．5 目的基因PAL的回收纯化

2．2．6 大肠杆菌感受态的制备(CaCl2-MgCl2法)

2．2．7 连接及转化

2．2．8 筛选与鉴定

2．2．9 生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 cDNA的获得

2．3．2 目的基因PAL的克隆

2．3．3 膜荚黄芪PAL基因ORF分析结果

2．3．4 膜荚黄芪PAL基因信号肽分析

2．3．5 膜英黄芪PAL酶活性位点分析

2．3．6 膜荚黄芪PAL基因同源性分析

2．4 讨论

3 膜荚黄芪AmPAL基因在毕赤酵母中的分泌表达

3．1 材料

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 工具酶

3．1．3 培养基

3．1．4 常用溶液

3．2 方法

3．2．1 表达载体pPIC9K-AmPAL的构建

3．2．2 表达载体pPIC9K-PAL的鉴定

3．2．3 表达载体pPIC9K-PAL电转毕赤酵母GS115

3．2．4 高拷贝转化子的筛选

3．2．5 重组酵母GS115-pPIC9K-AmPAL的菌落PCR鉴定

3．2．6 重组酵母GS115-pPIC9K-AmPAL的诱导表达

3．2．7 SDS-PAGE蛋白电泳检测

3．2．8 PAL的纯化

3．2．9 Bradford法测PAL蛋白浓度

3．2．10 重组酵母表达产物PAL酶活性测定

3．3 结果与分析

3．3．1 表达载体pPIC9K-AmPAL的鉴定

3．3．2 表达载体pPIC9K-AmPAL的转化与筛选

3．3．3 重组酵母GS115-pPIC9K-AmPAL菌落PCR鉴定

3．3．4 蛋白PAL的诱导表达

3．3．5 蛋白PAL的纯化

3．3．6 PAL酶活分析

3．4 讨论

4 膜荚黄芪AmPAL基因在大肠杆菌中的胞内表达

4．1 材料

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 工具酶

4．1．3 培养基

4．2 方法

4．2．1 膜荚黄芪AmPAL基因的克隆

4．2．2 表达载体pET32a-AmPAL的构建及其鉴定

4．2．3 pET32a-AmPAL转化大肠杆菌BL21及其鉴定

4．2．4 AmPAL在大肠杆菌BL21中的诱导表达

4．2．5 PAL粗酶活测定

4．3 结果与分析

4．3．1 AmPAL基因的克隆

4．3．2 大肠杆菌BL21-pET-32a-AmPAL的诱导表达及活性分析

4．4 讨论

5 大豆GmPAL基因在毕赤酵母中的分泌表达

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果与分析

5．3．1 大豆GmPAL基因的生物信息学分析

5．3．2 重组酵母GS115-pPIC9K-GmPAL

5．4 讨论

6 结论和展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录1

附录2 AmpAL构建到pET32a上得测序结果

附录3 硕士期间发表的文章