链霉素敏感rpsL基因用于Red反向筛选的探索

摘要

应用Red重组结合正向和反向筛选，通过两步操作和筛选可以在大肠杆菌染色体基因组上实现完全无痕的基因敲除和敲入。前期文献显示，相对于耐药基因(strR)链霉素敏感基因(strS)呈显性表型，因此strS（rpsL）基因是具有潜力的反向筛选基因。
　　本研究在在构建用于Red重组系统正反向筛选的strS-kanR筛选盒时发现，在strS基因呈多拷贝时可以使耐药的大肠杆菌TOP10菌株呈链霉素敏感表型，而呈单拷贝时，菌株仍呈链霉素抗性表型，可见strS和strR基因间不是简单的开关性的显隐性关系，要使菌株呈链霉素敏感表型应适当提高strS基因的表达拷贝数。为提高strS基因的表达拷贝数，本研究尝试在strS基因前加一个Lac启动子，并以此进一步构建PLacstrS-kanR筛选盒。结果显示，在构建PLacstrS片段时，strS基因在高表达量时呈现对宿主菌会产生生长不利的现象;在进一步构建PLacstrS-kanR筛选盒时，未挑到含有双Lac启动子的正向重组质粒pMD_PLacstrS-kanR(+)的转化菌。以转化pUC19质粒的TOP10菌株为对照，对转化了pMD_strS(+)、 pMD_strS（-）、 pMD_strS-kanR(+)、 pMD_strS（-）、pMD_PLacstrS-kanR（-）5种不同结构质粒的TOP10菌株，以及strS基因在染色体基因组中呈单拷贝的TOP10ΔflgK菌株进行生长曲线测定，结果转化了载体上Lac启动子与strS基因呈反向质粒pMD_strS（-）和pMD_strS-kanR（-）的菌株的生长有轻度影响，转化了呈正向质粒pMD_strS(+)和pMD_strS-kanR(+)的菌株的生长影响略加重，转化了pMD_PLacstrS-kanR（-）质粒菌株可能受载体结构上的潜在启动子影响生长受到了严重的影响，而TOP10ΔflaK菌株的生长与对照菌株基本接近。可见rpsL基因的过量表达对大肠杆菌生长有不利影响，甚至有致死性。

目录

声明

论文说明

缩略词表

摘要

第一章 文献综述

1．Red同源重组

1．1 Red同源重组系统的作用机理及相关质粒介绍

1．2 Red同源重组的应用

1．3 反向筛选标记

2．链霉素作用机理

2．1 核糖体简介

2．2 核糖体蛋白S12与链霉素作用机理

2．3 链霉素耐药相关基因及耐药机制

3、细菌鞭毛

第二章 strS-kanR筛选盒的构建及对大肠杆菌TOP10 flgK基因的敲除试用

1．材料

1．1 质粒与菌株

1．2 工具酶与生化试剂

1．3 培养基

1．4 抗生素

1．5 主要溶液

2．方法

2．1 实验所用的引物及设计

2．2 strS-kanR筛选金的构建

2．3 大肠杆菌TG1和TOP10感受态细胞的制备

2．4 strS-kanR筛选盒的克隆与转化

2．5 克隆的筛选

2．6 pMD_strS-kanR质粒的提取和转化

2．7 含有重组质粒pMD_strS-kanR TOP10菌株链霉素敏感性的检测

2．8 strS-kanR筛选盒的在大肠杆菌TOP10中敲除flgK基因的试用

2．9 敲除菌株的鉴定

3．结果

3．1 strS-kanR筛选盒的构建

3．2 含有pMD_strS-kanR重组质粒的鉴定

3．3 敲除菌株的鉴定

4．讨论

第三章 strS-kanR筛选盒的改进及rpsL基因致死性作用的研究

1．材料

1．1 质粒与菌株

1．2 工具酶与生化试剂

1．3 培养基

1．4 抗生素

1．5 主要溶液

2．方法

2．1 实验中所用到的引物及设计

2．2 含有pMD_strS重组大肠杆菌的构建及鉴定

2．3 PLacstrS-kanR抗生素金的构建及含pMD_PLacstrS-kanR重组克隆的大肠杆菌的构建和鉴定

2．4 重组菌株链霉素最小抑菌浓度的测定

2．5 重组菌株生长曲线的测定

3．结果

3．1 PLacstrS片段构建的构建及鉴定结果

3．2 含有pMD_PLacstrS-kanR重组克隆的大肠杆菌的构建和鉴定

3．3 重组菌株链霉素最小抑菌浓度的测定结果

3．4 重组菌株生长曲线的测定

4．讨论

小结

研究创新点

参考文献

附录：实验仪器及设备

攻读硕士阶段的研究成果

致谢