新的胃癌相关肿瘤抑制因子CXXC4的表观遗传调控作用及其机制研究

摘要

背景:胃癌是最常见的消化道系统恶性肿瘤之一，也是全球范围内发病率第二位的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。除了遗传学的改变外，表观遗传调控紊乱在胃癌的发生发展中也日益受到关注，可导致许多致瘤信号通路的异常激活。作为表观遗传调控网络中的重要成员之一，EZH2在多种肿瘤中均呈高表达状态，但其在胃癌中导致致瘤信号异常激活的机制仍不清楚。
　　目的:目前已有研究证实CXXC4在肾细胞癌中是经典Wnt信号通路的负向调控因子，但其具体分子作用机制和生物学功能尚未明确。我们希望通过一系列体内体外实验来明确CXXC4基因的生物学功能及抑制肿瘤发生发展的分子调控机制。具体来说，我们想知道CXXC4是否在胃癌中也参与对Wnt信号通路的调控。本研究中将首次提出CXXC4是EZH2下游的一个直接靶基因;证实CXXC4是一个新的胃癌相关肿瘤抑制因子;阐明EZH2可通过抑制CXXC4的表达来激活Wnt和MAPK等致瘤信号通路，从而促进肿瘤的发生发展。
　　方法:首先我们在胃癌细胞系中利用EZH2 siRNA处理前后基因表达的微阵列分析筛选了一系列EZH2下游的靶基因，并通过qPCR验证，最终选定CXXC4基因做进一步研究，发现其表达受到EZH2的显著抑制。接下来我们运用ChIP(ChromatinImmunoprecipitation)实验以明确EZH2对CXXC4的表达调控是直接作用还是间接作用。通过免疫组化和mRNA原位杂交技术检测EZH2和CXC4在组织水平上表达的相关性。构建CXXC4的真核表达载体(pCMV-3Tag7-CXXC4)和CXXC4shRNA(pSUPERi-CXXC4)，观察外源性CXXC4对细胞表型的影响，如运用MTS和软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力等。构建Doxcycline诱导CXXC4稳定表达的细胞株和CXXC4稳定敲除细胞株，建立裸鼠成瘤模型以进一步验证体内CXXC4对肿瘤生长的影响。构建CXXC4与其相互作用蛋白的关键位点突变体，运用免疫共沉淀(Co IP)，Western Blot和ELISA等方法阐明CXXC4抑制肿瘤发生发展的表观遗传机制。
　　结果:本研究中首次证实CXXC4是受到EZH2直接调控的一个新的靶基因。EZH2通过直接结合CXXC4基因的启动子区域抑制其转录进而抑制其表达。体内外实验均证实CXXC4能有效抑制肿瘤细胞的生长;同时，与正常胃粘膜上皮细胞和正常胃组织相比，CXXC4在胃癌细胞和原发胃癌组织中均呈低表达状态，CXXC4的表达下调降低了早期胃癌患者的生存预后(p＜0.05)。因此，首次提出CXXC4是一个新的肿瘤抑制因子。机制上，CXXC4通过失活Wnt和MAPK信号通路抑制肿瘤的发生发展。CXXC4的敲除（siRNA or shRNA）可激活Wnt和MAPK信号通路并促进细胞的锚定非依赖性生长。CXXC4通过稳定β-catenin降解复合物(β-catenindestruction complex)的完整性来抑制wnt信号通路，并通过破坏Erk1/2与MEK1/2之间的相互作用抑制MAPK的激活。最后，EZH2促进Wnt和MAPK信号通路的激活可被过表达的CXXC4所抑制，而CXXC4的敲除逆转了EZH2 siRNA介导的对wnt和MAPK通路的抑制作用。
　　结论:CXXC4是受到EZH2直接调控的一个新的胃癌相关肿瘤抑制因子，其表达水平是早期胃癌患者的一个重要预后因素。EZH2可通过下调CXXC4的表达激活Wnt和MAPK信号通路从而促进肿瘤的发生发展。
　　创新点:
　　1.CXXC4是一个新的胃癌相关肿瘤抑制因子。
　　2.CXXC4是EZH2下游的一个新的直接靶基因。
　　3.CXXC4的表达是早期胃癌患者的一个重要预后因素。
　　4.CXXC4通过稳定β-catenin降解复合物的完整性抑制Wnt信号通路的激活。CXXC4的C末端的两个关键氨基酸位点K161和T162对其与Dvl的相互作用及β-catenin的降解至关重要。
　　5.CXXC4通过直接结合ErK1/2及破坏Erk1/2与MEK1/2之间的相互作用抑制MAPK信号通路。
　　6.EZH2通过下调CXXC4的表达激活了Wnt和MAPK信号通路从而促进胃癌的发生发展。