白细胞介素1β对骨髓中性粒细胞与嗜酸性粒细胞分化的调控及其相关机制

摘要

哮喘是由多种细胞及细胞组分，包括嗜酸性粒细胞(Eos)、中性粒细胞(Neut)、淋巴细胞、肥大细胞等炎症细胞及炎症介质、细胞因子等所形成的气道内炎症细胞浸润、黏液分泌增多、气道高反应性(AHR)、成纤维细胞及上皮细胞增生、平滑肌细胞肥大及气道重塑，其本质是一种慢性气道炎症。一直以来，多项研究发现哮喘是以Th2细胞反应为主的嗜酸性粒细胞性气道炎症，对激素治疗效果明显，而临床上发现以中性粒细胞性气道炎症为主的哮喘患者对激素治疗效果不明显，甚至出现恶化的表现，这部分哮喘又称之为中性粒细胞性哮喘，即难治性哮喘、重症哮喘。由此可见，气道嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润在哮喘的病理生理过程及临床症状的发展中起关键作用，阻断气道嗜酸性粒细胞及中性粒细胞性炎症对哮喘的治疗有决定性意义。
　　白细胞介素1β(IL-1β)是IL-1家族的成员之一，作为一种重要的前炎症因子参与多种疾病的发生发展。多项研究发现IL-1β在哮喘尤其是重症哮喘的发病过程中发挥重要的作用，而且与气道内嗜酸性粒细胞及中性粒细胞的升高密切相关，尽管其机制并不明确。甚至临床研究认为IL-1β可以作为区别哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的生物学标记。另外，有文献报道IL-1β干预后可以引起骨髓造血干祖细胞向髓系的分化，由此我们假设IL-1β是否可以直接参与骨髓造血干祖细胞向Neut及Eos分化的调控，从而为IL-1β在哮喘发病机制的探究做铺垫，开拓新的视野，为哮喘的临床治疗提供新的防治靶点。
　　目的:探讨IL-1β对骨髓造血干祖细胞向中性粒细胞和嗜酸性粒细胞分化的调控及其相关机制，从而为IL-1β在哮喘的发病机制提供新的理论契机。
　　方法:健康同周龄WT小鼠与IL-1R敲除（IL-1 R-/-）小鼠，分为四组:WT小鼠生理盐水对照组（WT-NS组），WT小鼠LPS模型组（WT-LPS组），IL-1R-/-小鼠生理盐水对照组（IL-1R-/--NS组）及IL-1R-/-小鼠LPS模型组（IL-1R-/--LPS组）。气道滴注脂多糖(LPS)（1mg/kg小鼠）或者生理盐水(NS)，24小时内检测支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血中性粒细胞比例;流式细胞术检测和分析骨髓中性粒细胞(Gr-1+CD11b+)，并进一步分析原始中性粒细胞(Pro/mye，Gr-1intCD11bint)，非成熟中性粒细胞(imNeut，Gr-1hiCD11blo)及成熟中性粒细胞(mNeut，Gr-1hiCD11bhi)这三群细胞的比例。其中原始中性粒细胞(Pro/mye)包括原幼粒细胞和中幼粒细胞，非成熟中性粒细胞(imNeut)包括晚幼粒细胞和杆状粒中性粒细胞，成熟中性粒细胞(mNeut)即分叶核中性粒细胞。利用IL-1R-/-小鼠与WT小鼠构建骨髓移植及Neut炎症模型:健康C57BL/6雌鼠作为受体鼠先接受化疗，腹腔注射白消胺(BU)，30mg/kg，每日1次，连续4天，腹腔注射环磷酰胺(CTX)，50mg/kg，每日1次，连续2天，中间休息1天后，第8天，提取同周龄的供体鼠（IL-1R-/-雄鼠与WT雄鼠）的骨髓细胞，按2-4×107cells/小鼠为受体雌鼠进行尾静脉注射，待第21天受体鼠骨髓造血系统基本恢复进行造模，随机分为四组:WT小鼠回输生理盐水对照组（WT-WT-NS组）、WT小鼠回输LPS模型组(WT-WT-LPS组)、敲除小鼠回输生理盐水对照组（IL-1R-/--WT-NS组）、敲除小鼠回输LPS模型组（IL-1R-/--WT-LPS组），气道滴注NS及LPS（1ug/g小鼠）24时内进行模型处理，检测方法同上。体外Neut克隆形成实验检测IL-1β对Neut分化的影响，液态培养诱导骨髓Neut分化并流式检测Neut、AnnexinⅤ/PI、E.coli吞噬等进一步研究IL-1β干预对Neut分化、凋亡及功能的影响。实时定量PCR(Q-PCR)检测骨髓Neut分化过程中关键转录因子，包括G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表达。同时，体外半固态及液态培养检测IL-1β对嗜酸性粒细胞(Eos)分化的影响:Eos半固态克隆形成实验检测并比较对照组（IL-5）及实验组(IL-5+IL-1β)Eos的克隆形成情况;流式检测液态诱导Eos分化过程中IL-5和或IL-1β干预后Eos的(SiglecF+)水平，并利用BrdU方法检测Eos增殖及凋亡水平;Q-PCR检测Eos分化过程中关键转录因子GATA-1及重要调控分子MBP-1的表达。
　　结果:在Neut炎症模型中，与WT-LPS组相比，IL-1R-/-LPS组BALF-Neut总数有下降趋势，尽管没有统计学意义(P＞0.05，P=0.0571)，外周血Neut比例明显降低(P＜0.05)，骨髓Pro/mye比例无明显变化(P＞0.05)，但是骨髓imNeut比例明显增加(P＜0.05)，mNeut比例明显降低(P＜0.001)。利用IL-1R-/-小鼠与WT小鼠进行骨髓移植并构建Neut炎症模型，比较IL-1R-/-WT-LPS组与WT-WT-LPS组，前者BALF-Neut比例有下降趋势，尽管没有统计学意义(P＞0.05，P=0.0503)，外周血Neut炎症明显缓解(P＜0.01)，骨髓Pro/mye比例无明显变化(P＞0.05)，骨髓imNeut比例变化也不明显(P＞0.05)，而mNeut比例明显降低(P＜0.001)。中性粒细胞体外诱导分化液态培养结果发现，IL-1β单独干预对Neut的分化无明显影响(P＞0.05)，而在G-CSF的协同作用下可以明显促进Neut的分化(P＜0.001)，但对Neut凋亡抑制作用不明显(P＞0.05)，并对Neut吞噬功能也有一定的促进作用(P＜0.05)。体外半固态培养发现，IL-1β在G-CSF协同的作用下明显促进Neut-CFU的形成(P＜0.01)。Q-PCR检测Neut分化过程中关键的转录因子，结果发现与WT-NS组相比，WT-LPS组G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表达水平升高(P＜0.05)，而IL-1R-/--LPS组骨髓G-CSFR、 C/EBPε、PU.1及C/EBPα的mRNA表达水平与IL-1R-/-NS组比较则无明显变化(P＜0.05)。嗜酸性粒细胞体外半固态及液态培养结果:Eos半固态克隆形成实验结果显示实验组(IL-5)Eo-CFU数量与对照组（IL-5）相比无明显变化(P＞0.05);Eos液态培养诱导分化，第8-10天收集细胞流式检测Eos分化水平及凋亡情况，结果显示在IL-5的作用下，Eos逐渐分化成熟，但IL-1β干预后并不影响Eos的分化(P＞0.05)，且实验组与对照组中Eos相关转录因子(GATA-1)及重要调控蛋白(MBP-1)的mRNA表达也无明显差别(P＞0.05)。Eos液态培养第10天进行BrdU流式检测发现，尽管实验组与对照组相比S期细胞比例无明显差别，但凋亡细胞群却明显减少。
　　结论:IL-1β在G-CSF协同作用下明显促进Neut的分化，这一作用可能是通过上调G-CSFR、C/EBPε、PU.1及C/EBPα的表达而实现，而单独作用影响不明显。同时，IL-1β还能促进Neut的吞噬功能，但对其凋亡无明显影响。另外，IL-1β不影响骨髓Eos的分化与增殖，但是能抑制Eos的凋亡。