嫁接提高黄瓜温度胁迫抗性的生理与分子机制研究

摘要

黄瓜是温室栽培的主要蔬菜作物之一，其生长发育易受不利环境条件的影响。温度胁迫是影响黄瓜生长发育，产量和品质的主要因子之一。嫁接是缓解温度胁迫等逆境的有效手段，并已在生产中广泛应用。然而，逆境条件下抗性砧木调控地上部的生理与分子机制及相关的长距离运输信号尚不清楚。本文以黄瓜（Cucumis sativus L.）为接穗，以耐低温的黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia）或耐高温的丝瓜(Luffa cylindrica(L.) M.Roem.)为砧木进行嫁接，研究了抗性砧木对黄瓜低温或高温胁迫抗性的影响。本文利用嫁接技术从抗性基因表达、激素代谢、H2O2信号和microRNA调控的角度探讨了根系调控地上部逆境抗性的生理与分子机制。所得主要结果如下: 1.将黄瓜嫁接到黑籽南瓜或丝瓜上分别缓解了亚适宜低温或高温引起的地上部生物量积累、光合能力的降低和膜质过氧化以及蛋白氧化。黑籽南瓜或丝瓜砧木在低温或高温生长条件下上调了一系列涉及信号转导(MAPK和RBOH)，转录调控(MYB和MYC)，蛋白保护(HSP45.9和HSP70)，抗氧化（Cu/Zn-SOD，cAPX和GR）和光合作用（RBCL，RBCS，RCA和FBPase）的基因，并且伴随着叶片相应酶活性和谷胱甘肽还原态比例的提高。此外，高温条件下丝瓜砧木强烈诱导了HSP70基因和蛋白的表达，而低温或高温条件下黑籽南瓜砧木对HSP70只有轻微的诱导。这些结果表明，温度胁迫条件下，砧木通过某种未知信号引起胁迫响应、防御相关基因表达和ROS清除能力的变化来调控地上部的抗逆反应。 2.我们对黄瓜自根嫁接植株和丝瓜嫁接植株分别进行根际高温，地上部高温和整体高温处理，具体分析其光合作用光反应和暗反应，ROS积累和清除的响应。研究表明，短暂的根际高温和地上部高温对不同嫁接植株捕获光能没有显著影响。根际高温引起气孔关闭，降低了胞间CO2浓度并抑制了卡尔文循环关键酶Rubisco的基因表达及活性，进而抑制了光合电子传递终端受体NADP+的再生。因此光合电子传递在终端受阻，光合电子传递效率降低，导致过剩的电子传递给O2，形成O2·-和H2O2，造成氧化胁迫。而地上部高温主要通过直接造成光系统Ⅱ供体侧放氧复合体(OEC)，受体侧QA、PQ库等的减少或失活，导致光合电子越过QA-受阻，进而造成ROS的积累。丝瓜砧木有效缓解了根际高温或地上部高温对光合电子传递的阻断，提高了ROS清除能力，最终缓解了氧化胁迫。 3.研究了植物激素ABA作为长距离运输信号在丝瓜砧木诱导高温抗性中的作用。研究表明丝瓜砧木缓解了根际高温，地上部高温及整体高温造成的黄瓜接穗光合性能的降低和氧化胁迫。这与高温下丝瓜砧木诱导保护蛋白HSP70的大量合成有着密切的联系。同时我们发现根际或/和地上部高温处理后丝瓜嫁接植株叶片ABA含量显著增加。地上部高温处理，丝瓜嫁接植株叶片增加的ABA含量来自于叶片的合成;而地下部高温处理，丝瓜嫁接植株叶片增加的ABA含量来自于根部的向上运输。通过外源喷施ABA发现，适宜浓度的ABA提高了黄瓜自根嫁接植株的高温抗性，并且上调了HSP70基因和蛋白的表达。因此，高温条件下丝瓜砧木诱导的ABA通过上调HSP70的表达提高了地上部的高温抗性。 4.研究了质外体H2O2作为信号分子在丝瓜诱导的高温抗性中的作用。根际或/和地上部高温处理后，丝瓜嫁接植株编码NADPH氧化酶的RBOH基因显著上调表达，H2O2的含量显著增加，且H2O2主要分布于叶肉细胞细胞壁的背壁。外源喷施H2O2显著提高了自根嫁接植株的高温抗性，而用DMTU清除H2O2或DPI抑制H2O2产生后丝瓜砧木诱导HSP70表达和高温抗性的作用消失了。正常温度或高温条件下，外源喷施适宜浓度ABA诱导了自根嫁接植株质外体H2O2的积累及HSP70的表达。高温条件下外源喷施适宜浓度H2O2促进了HSP70的上调表达。而DMTU或DPI处理抵消了ABA对自根嫁接植株HSP70及高温抗性的诱导。这些结果强烈表明，质外体H2O2参与了丝瓜砧木诱导的高温抗性，并且通过介导ABA诱导HSP70表达发挥作用。 5.研究了丝瓜砧木诱导高温抗性的过程中microRNA的调控作用。高温胁迫下，丝瓜作为砧木诱导了黄瓜接穗抗性相关基因的表达及抗性。我们利用已有的植物miRNA芯片分析了高温及丝瓜砧木对黄瓜叶片miRNA表达的影响。正常条件下，与自根嫁接植株相比，丝瓜嫁接植株有23条miRNA显著上调表达和8条miRNA显著下调表达;而高温处理后，与各自对照相比，自根嫁接植株有4条miRNA显著下调表达，而丝瓜嫁接植株有条3条miRNA显著上调表达和54条miRNA显著下调表达（log2＞1.5或＜-1.5）。通过对差异表达miRNA进行靶基因预测及其功能分析发现27％的靶基因与逆境响应有关，涉及激素响应，信号传导，转录调控和蛋白保护等多个方面。高温处理后，丝瓜嫁接植株叶片ABA含量显著增加，且csa-miR59b显著下调而其预测靶基因CsGAMYB1显著上调表达。高温条件下，外源喷施ABA促进了csa-miR59b的下调和CsGAMYB1的上调表达。因此，ABA可能通过调控csa-miR159b参与了丝瓜砧木诱导的高温抗性。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 植物对温度逆境的响应及其适应机制简述

1．1．1 温度逆境对植物的影响

1．1．2 植物应答低温胁迫的机制

1．1．3 植物应答高温胁迫的机制

1．2 嫁接提高园艺作物逆境抗性的应用及其机制研究

1．3 ABA与植物逆境抗性及其信号转导

1．4 microRNA与植物逆境应答

1．5 本文的研究目的和意义

2 抗性砧木提高黄瓜亚适宜温度适应性

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料与试验设计

2．1．2 光合气体交换测定

2．1．3 MDA含量和氧化蛋白水平测定，超氧阴离子(O2·-)NBT染色

2．1．4 Rubisco和FBPase活性测定

2．1．5 谷胱甘肽含量测定

2．1．6 抗氧化酶活性测定

2．1．7 荧光定量PCR分析

2．1．8 HSP70蛋白水平检测

2．2 结果

2．2．1 温度处理和砧木对植株生长和氧化胁迫的影响

2．2．2 温度处理和砧木对接穗光合速率的影响

2．2．3 温度处理和砧木对接穗光合相关基因表达及酶活性的影响

2．2．4 温度处理和砧木对接穗不同抗逆基因表达的影响

2．2．5 温度或砧木对黄瓜抗氧化能力和氧化还原状态的影响

2．2．6 温度处理和砧木对接穗HSP70蛋白木平的影响

2．3 讨论

2．3．1 抗性砧木缓解了亚适宜温度对接穗生长和光合碳同化的抑制

2．3．2 亚适宜温度条件下抗性砧木诱导了叶片基因表达的变化

2．3．3 亚适宜温度条件下抗性砧木影响了地上部ROS产生，氧化还原状态和光合相关酶活性

3 高温抑制黄瓜光合作用的机制及丝瓜砧木的缓解作用

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料与试验设计

3．1．2 光合气体交换测定和荧光定量PCR分析

3．1．3 叶绿素荧光参数测定

3．1．4 NADP+／NDAPH的测定

3．1．5 O2·-和H2O2组织化学染色

3．1．6 相对电导率(REC)的测定

3．1．7 谷胱甘肽含量和抗氧化酶活性的测定

3．2 结果

3．2．1 高温对黄瓜嫁接植株光合作用的影响

3．2．2 高温对黄瓜嫁接植株光系统能量分配和电子传递的影响

3．2．3 高温对黄瓜嫁接植株光合电子传递链供体侧和受体侧的影响

3．2．4 高温对黄瓜嫁接植株光合电子传递链终端受体NADP+的影响

3．2．5 高温对黄瓜嫁接植株卡尔文循环关键酶活性的影响

3．2．6 高温对黄瓜嫁接植株根系活力和气孔开闭的影响

3．2．7 高温对黄瓜嫁接植株活性氧积累的影响

3．2．8 高温对黄瓜嫁接植株抗氧化能力的影响

3．3 讨论

4 ABA通过诱导HSP70参与了丝瓜砧木诱导的高温抗性

4．1 材料与方法

4．1．1 供试材料与试验设计

4．1．2 光合气体交换

4．1．3 叶绿素含量的测定

4．1．4 荧光参数Fv／Fm测定

4．1．5 MDA含量和氧化蛋白水平测定

4．1．6 木汁液提取和植物内源ABA水平测定

4．1．7 蛋白提取及HSP70蛋白水平检测

4．1．8 荧光定量PCR分析

4．2 结果

4．2．1 丝瓜砧木提高黄瓜高温抗性

4．2．2 热激蛋白参与丝瓜砧木诱导的高温抗性

4．2．3 ABA通过谤导HSP70参与了丝瓜砧木诱导的高温抗性

4．3 讨论

5 质外体H2O2介导了丝瓜砧木诱导的高温抗性

5．1 材料与方法

5．1．1 供试材料和试验设计

5．1．2 光合气体交换

5．1．3 相对电导率测定

5．1．4 荧光参数的测定

5．1．5 H2O2含量的测定和亚细胞染色

5．1．6 荧光定量PCR分析

5．1．7 HSP70蛋白水平检测

5．2 结果

5．2．1 高温胁迫下，丝瓜砧木对质外体H2O2积累的影响

5．2．2 H2O2介导了ABA或丝瓜砧木诱导的高温抗性

5．2．3 H2O2介导了ABA或丝瓜砧木诱导的HSP70表达

5．3 讨论

6 microRNA在丝瓜砧木诱导高温抗性中的作用

6．1 材料与方法

6．1．1 供试材料和试验设计

6．1．2 光合速率测定

6．1．3 miRNA芯片杂交及数据分析

6．1．4 miRNA荧光定量PCR验证

6．1．5 差异表达miRNA靶基因预测及功能注释和分类

6．1．6 mRNA荧光定量分析

6．1．7 ABA含量测定

6．2 结果

6．2．1 不同嫁接植株生长状况及抗逆基因对高温胁迫的响应

6．2．2 高温处理后，两种嫁接植株microRNA差异表达分析

6．2．3 差异表达miRNA的qRT-PCR验证

6．2．4 差异表达miRNA靶基因预测及功能注释和分类

6．2．5 csa-miR159及其预测靶基因CsGAMYB1 qRT-PCR检验

6．2．6 ABA对csa-miR159b及其预测靶基因的调控作用

6．3 讨论

7 总结

参考文献

攻读博士学位期间学术成果