利用RNA干扰方法控制褐飞虱的探索及对转基因Bt水稻S21的评价研究

摘要

褐飞虱（Nilaparvata lugens St(a)l）是许多亚洲国家水稻的重要害虫，其通过口针刺吸水稻进行危害，造成水稻严重的生理破坏。褐飞虱爆发频率高，防治难度大，对我国水稻生产造成巨大损失。开辟新的防治途径控制褐飞虱危害势在必行。 目前RNAi技术已发展成为研究功能基因组的强大工具而被广泛应用于昆虫基因功能的研究，通过dsRNA进行基因敲除已经在多个目的昆虫中获得成功。近几年来特别重要的进展是通过转基因农作物表达dsRNA成功实现了对鳞翅目和鞘翅目等害虫的控制。 本论文对dsRNA在人工饲料中的稳定性进行了测定，结果表明48小时内dsRNA在人工饲料中保持稳定。我们根据褐飞虱测序结果选取了两个编码ATPase D（命名为173）、ATPase H（命名为322）的EST序列为靶标基因，并在体外合成了相应的dsRNA。通过人工饲喂3龄褐飞虱若虫体外合成的dsRNA，研究了dsRNA对其靶标基因表达的影响。qRT-PCR分析发现，褐飞虱取食dsRNA后其靶标基因转录水平明显降低。在其靶标基因dsRNA浓度为0.5μ g/μl饲喂8天后，基因173的转录水平降低了47％，基因322转录水平降低了42％。并且基因173在其dsRNA浓度为0.5μg/μl时导致褐飞虱生长受到抑制并且产生致死表型，说明173基因可能在褐飞虱生长发育中起着重要的作用，可能是一个RNAi防治褐飞虱重要的靶标基因。 以前研究证实EcR(Ecdysone receptor)和TPS（Trehalose phosphate synthase）在褐飞虱的生长发育中起着重要的作用。本论文我们分别选取了基因173（V-ATPase D）、EcR和TPS等三个基因为靶标基因，构建了可表达目的基因hpRNA的RNAi载体，并利用农杆菌侵染转化获得了转基因水稻。对转化得到的植株进行分子鉴定，表明转基因水稻植株可表达产生靶标基因的dsRNA和siRNA。褐飞虱若虫取食3种转基因水稻后，它们的靶标基因转录水平均有一定程度的降低，但并未发现有明显的致死表型。取食转基因水稻后，褐飞虱的发育历期、世代周期变长，短翅型雌虫生殖力降低，但体重、存活等方面均无明显变化。为研究褐飞虱连续世代取食转基因水稻对RNAi效果有无加强作用，我们又对在转基因水稻上继代饲养第三代褐飞虱进行了测定。褐飞虱的1龄、5龄若虫及若虫发育历期均显著变长，褐飞虱体内靶标基因转录水平仍被降低，但褐飞虱短翅雌虫生殖力、体重和存活等方面均无明显变化，未有致死表型出现。利用转基因水稻干扰靶标基因进行褐飞虱防治未能成功的原因可能是所选择的基因被沉默的效率不足以引起褐飞虱死亡，或者由于所用实验系统产生的dsRNA效率不足以产生有效的RNAi效果而引起致死性的发生。 水稻是重要的粮食作物之一，在其生长过程中深受二化螟Chilo suppressalis(Walker)、三化螟Tryporyza incertulas(walker)及稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis(Guenee)等鳞翅目害虫的危害，因此转基因Bt水稻被广泛研究用于水稻害虫的治理。但由于转基因Bt水稻的安全问题而延缓了商业化种植的进程。为解决人们关心的安全性问题及Bt抗性问题，我们获得了利用绿色启动子pGreen驱动融合基因Cry1Ac/Cry1I-like进行表达的转基因水稻株系S21。本论文进一步对其抗虫性能等方面进行了评价。 实验室和大田生测结果表明，S21对水稻害虫二化螟、稻纵卷叶螟有很高的抗性。2013年大田调查结果显示，对照秀水134遭受二化螟的危害率为8.76％，稻纵卷叶螟的危害率为40.47％;而S21未遭受二化螟和稻纵卷叶螟危害。通过ELISA进行蛋白含量检测，目的融合蛋白在绿色组织特异性表达而种子中不表达，生长25天的茎杆、叶子具有比较高的表达量，其含量分别为670～1160 ng/g、1050～1510 ng/g，种子中表达量极低(0～7.57 ng/g)。S21的主要农艺性状同对照秀水134比较，没有明显差异。初步评价表明，转基因Bt水稻株系S21具备良好的商业化种植应用前景。

目录

声明

致谢

摘要

1．文献综述

1．1 褐飞虱概述

1．1．1 褐飞虱形态特征

1．1．2 褐飞虱分布

1．1．3 褐飞虱危害特点

1．1．4 褐飞虱防治状况

1．2 RNAi(RNA interference)概述

1．2．1 RNAi的分子机制

1．2．2 RNAi的特点

1．2．3 昆虫RNAi实现方法

1．2．4 影响RNAi效率的因素

1．2．5 RNAi在植物中的应用

1．2．6 RNAi在昆虫中的应用

1．2．7 RNAi载体构建方法

1．3 V-ATPase概述

1．3．1 V-ATPase的结构

1．3．2 V1的结构

1．3．3 V0的结构

1．3．4 V-ATPase活性的调节

1．3．5 V-ATPase的功能

1．4 EcR(ecdysone receptor)概述

1．4．1 EcR的结构

1．4．2 EcR的功能

1．5 海藻糖合成酶(trehalose phosphate synthase，TPS)概述

1．5．1 海藻糖的功能

1．5．2 海藻糖合成酶基因的研究

1．6 研究目的和意义

2．材料和方法

2．1 材料

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 植物材料

2．1．3 菌株

2．1．4 主要工具酶

2．1．5 主要试剂和试剂盒

2．1．6 各种培养基的配置

2．1．7 常用仪器

2．2 论文中涉及常用分子生物学实验方法

2．2．1 CTAB法提取植物基因组DNA

2．2．2 PCR反应

2．2．3 PCR产物加A

2．2．4 凝胶回收

2．2．5 PCR产物纯化

2．2．6 质粒提取

2．2．7 酶切反应

2．2．8 连接反应

2．2．9 T克隆

2．2．10 大肠杆菌TG1感受态制备(CaCl2法)

2．2．11 大肠杆菌的转化

2．2．12 根瘤土壤农杆菌(LBA4404)感受态的制备

2．2．13 根瘤土壤农杆菌(LBA4404)的电击转化

3．褐飞虱饲喂法RNAi的研究

3．1 方法

3．1．1 dsRNA的合成

3．1．2 dsRNA稳定性的测定

3．1．3 褐飞虱dsRNA的饲喂

3．2 实验结果

3．2．1 dsRNA的合成

3．2．2 dsRNA稳定性的检测

3．2．3 饲喂dsRNA对褐飞虱的影响

3．3 小结

4．培育转基因水稻进行褐飞虱RNAi的研究

4．1 方法

4．1．1 干扰载体的构建

4．1．2 转基因水稻的培育

4．1．3 转基因水稻的鉴定

4．1．4 褐飞虱取食转基因水稻生测

4．2 实验结果

4．2．1 干扰载体的构建

4．2．2 转基因水稻的鉴定

4．2．3 褐飞虱取食转基因水稻生测

4．3 小结

4．4 总结与讨论

5．对绿色组织特异表达抗虫抗草甘膦转基因Bt水稻S21的评价

5．1 引言

5．2 研究背景

5．3 研究目的

5．4 材料与方法

5．4．1 试验材料

5．4．2 供试昆虫

5．4．3 试验方法

5．5 结果

5．5．1 转基因植株S21对草甘膦的抗性

5．5．2 转基因植株S21对二化螟的杀虫活性

5．5．3 转基因植株S21 Bt蛋白含量的测定

5．5．4 转基因植株S21农艺性状及抗虫效果

5．6 小结与讨论

参考文献

附录