基于农药介入后转Bt基因水稻对褐飞虱生态安全性评价的方法

摘要

本发明涉及农药介入后转Bt基因水稻对褐飞虱安全性评价的方法，即选用三唑磷和井冈霉素两种农药，在水稻分蘖期，模拟稻田喷雾施药法，分别向转Bt基因和亲本对照水稻用药，药后24h采集长势一致的水稻中下部茎杆，用以在光照培养箱内饲养褐飞虱初孵若虫，记录褐飞虱种群生长参数，分析对比种群发生指数；每穴盆栽水稻接100头3龄若虫，每24小时检查一次若虫存活情况，接虫后7d和14d观察比较水稻的受害级别；对农药处理后7天的两种水稻测定比较草酸含量。本发明为转Bt基因水稻对非靶标重要害虫褐飞虱危害的生态安全评价增加了切实性，且成本低、易于推广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于农药介入后转Bt基因水稻对褐飞虱安全性评价的方法。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物之一，害虫是造成水稻产量损失的重要因素，如鳞翅目害虫（二化螟、三化螟、大螟和稻纵卷叶螟等）造成的损失占亚洲年产量的2%～10%，我国每年因虫害造成的损失占水稻总产量的5%以上。随着生物技术的进步，抗鳞翅目害虫转Bt基因（苏云金芽胞杆菌）水稻品种成功问世，且很多研究证实它们对靶标害虫具有明显的抗性。但转Bt基因水稻并没有在世界范围内广泛地商业化生产，这很大程度上取决于它们的生态环境安全性和食品安全性。在生态环境安全性评价中，对非靶标害虫发生风险的评价是抗鳞翅目害虫转Bt基因水稻安全性评价的重要内容。

转Cry2A基因（一种毒蛋白表达基因）水稻T2A-1来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室分子生物学分室，转基因植物中引入的目的基因是人工改造合成的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）。自2005年，转基因抗虫水稻T2A-1已先后在湖北省进行了中间试验和环境释放，试验结果表明，T2A-1遗传稳定，对非靶标生物无害且农艺性状与原品种明恢63基本一致，对水稻主要危害性螟虫（二化螟和稻纵卷叶螟）具有极强和专一的毒性，但对非鳞翅目害虫均无任何抗性，尤其如水稻近年连续暴发成灾的重要害虫褐飞虱。为此，国内很多专家建立了一些转Bt基因水稻对稻飞虱影响的评价方法，如在转Bt基因水稻上人工饲养褐飞虱考察该害虫生长发育状况，或田间调查该害虫在转Bt基因水稻上的发生危害情况。这些方法能基本反应转Bt基因水稻对褐飞虱的直接影响，但却没有考虑水稻生产过程中其他环境因素的影响，尤其如化学防治的农药对褐飞虱的作用。实际上，虽然转Bt基因水稻可以对靶标鳞翅目害虫有较好的控制效果，但田间针对转Bt基因水稻非靶标害虫的化学农药无疑将继续使用。因此，建立一种农药介入后转Bt基因水稻对褐飞虱安全性评价的方法，将更加实际地为转Bt基因水稻中褐飞虱有效防控提供重要的技术支持。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种能切实为转Bt基因水稻对非靶标重要害虫褐飞虱的发生危害作出安全评价、易于推广使用的基于农药介入后转Bt基因水稻对褐飞虱安全性评价的方法。

本发明的实现方式为，基于农药介入后转Bt基因水稻对褐飞虱安全性评价的方法，包括以下步骤：

1）农药的选择：选用三唑磷、井冈霉素原药，浓度设置：三唑磷10、20、40、80ppm；井冈霉素100、200、400、800ppm；

2）处理方法：采用盆栽水稻接虫法，喷雾法施药；

3）喷药：在分蘖期喷洒盆栽水稻，喷洒时按农药浓度由低到高的顺序喷施，喷雾处理水稻叶片和茎干部分；处理后的盆栽水稻覆盖网罩，每个处理和对照均设置5个重复，以喷水作为对照代表未用农药处理；

4）安全性考察：

①褐飞虱种群生命参数：转Bt基因水稻和亲本对照水稻同时分别喷药24h后，采集长势一致的水稻中下部茎杆，置于玻璃杯内，两株水稻/杯，后每杯接初孵褐飞虱若虫10头，在光照培养箱内培育，每个处理5次重复；采用褐飞虱室内种群生命表法，记录处理过程中褐飞虱种群的生命参数―各龄期存活率及龄期、成虫羽化率、雌雄比、长短翅型比、雌虫寿命，计算种群趋势指数；

②水稻受害级别：在喷药24h后用80目纱网罩住盆栽水稻，每穴水稻接入100头3龄若虫，每盆300头，对照用水喷洒，所有供试水稻在自然田间下生长，每个对照和处理20次重复，每24小时检查一次若虫的存活情况，并作相应的若虫补充。分别在水稻接虫后7d和14d观察受害级别；

③水稻植株草酸：采用三氯化钛显色法测定草酸含量，取农药处理后7天的水稻植株，称重后用组织捣碎机破碎后过滤取汁，加入活性炭（加入量为原汁体积的1/4）在常温下脱色30min，然后用80-2型离心机分离活性炭，离心机转速为3000 r/min，溶液呈无色或呈乳白色后，取3ml稻汁加入0.15ml浓度为1%三氯化钛溶）显色，在分光光度计上于400 nm下测定吸光值，用草酸配制标准曲线，求出回归方程，由此求出草酸的含量。

本发明表明，井冈霉素、三唑磷两种农药使用后，对转Bt水稻和亲本对照水稻上褐飞虱种群的发生和水稻体内抗褐飞虱物质含量的影响存在显著差异，更切实地评价出了转Bt基因水稻对非靶标重要害虫褐飞虱发生危害的生态安全性。

本发明在操作程序上，基于农药田间实际应用浓度，围绕褐飞虱发生危害的三个重要考察指标，在室内和半田间即可操作完成，比较易懂掌握。本发明成本方面低廉，只要有一些养虫室、光照培养箱等昆虫饲养的基本设备和离心机、分光光度计测定仪器即可，易于推广使用。

附图说明

图1为井冈霉素处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）上褐飞虱的单雌产卵量的变化图；

图2为三唑磷处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）上褐飞虱的单雌产卵量的变化图；

图3为井冈霉素处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）上褐飞虱的种群趋势指数的变化图；

图4为三唑磷处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）上褐飞虱的种群趋势指数的变化图；

图5 为井冈霉素处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）茎秆中草酸含量的变化图；

图6 为三唑磷处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）茎秆中草酸含量的变化。

具体实施方式

本发明选用三唑磷、井冈霉素的原因在于：三唑磷是稻田常用防治螟虫的化学农药，但因为转Bt基因水稻在田间并非能对所有鳞翅目害虫，如大螟有好的防控作用，因此该药仍将在转Bt基因水稻田间使用；另一方面，已有研究证实三唑磷的不合理使用能刺激褐飞虱的生殖，即促进该害虫的发生危害。这种潜在风险在转Bt基因水稻上是否存在或是有所放大，这是本发明的重要内容。井冈霉素为稻田常规病害防治化学农药，在转Bt基因水稻也是常用农药，对害虫无直接毒杀作用，但可能通过影响水稻“体质”（体内抗稻飞虱指标）而间接影响褐飞虱的发生。因此，本发明选择三唑磷、井冈霉素两种与褐飞虱危害相关的稻田常用农药。

1、材料的选择及使用方法：

农药的选择：选择三唑磷、井冈霉素，试验所用农药均为原药，井冈霉素购自扬州先锋化工有限公司，三唑磷购自扬州长青农化有限公司。浓度设置：三唑磷10、20、40、80ppm；井冈霉素100、200、400、800ppm。

采用盆栽水稻接虫法，农药处理在水稻分蘖期按农药浓度由低到高的顺序，喷雾水稻叶片和茎干部分。转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）（Han Y., Xu XL., Ma WH., et al. 2011. The Influence of Transgenic cry1Ab/cry1Ac, cry1C and cry2A Rice on Non-Target Planthoppers and Their Main Predators Under Field Conditions. Agricultural Sciences in China, 10(11):1739-1747.）（来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室分子生物学分室，保存人承诺20年内向公众提供。

处理方法：采用盆栽水稻接虫法，施药喷雾法为与田间一致的喷雾法，喷雾器为装有一个直径1mm的锥形喷嘴,压力45 psi,流量300mL/min的简易适用设备。

喷药：在分蘖期喷洒盆栽水稻，喷洒时按农药浓度由低到高的顺序喷施，喷雾处理水稻叶片和茎干部分；处理后的盆栽水稻覆盖网罩，以防其他因素干扰。每个处理和对照均设置5个重复，以喷水作为对照。

2、安全性考察指标：

1）褐飞虱种群生命参数：在转Bt基因水稻和亲本对照水稻同时分别喷药24h后，采集长势一致的水稻中下部茎杆，置于玻璃杯内（两株水稻/杯），后每杯接初孵褐飞虱若虫10头，在光照培养箱内培育，每个处理5次重复。采用褐飞虱室内种群生命表法，记录处理过程中褐飞虱种群的生命参数（各龄期存活率及龄期、成虫羽化率、雌雄比、长短翅型比、雌虫寿命等，计算种群趋势指数）。

2）水稻受害级别：在喷药24h后用80目纱网罩住盆栽水稻，每穴水稻接入100头3龄若虫（每盆3穴），对照用水喷洒。所有供试水稻在自然田间下生长。每个对照和处理20次重复，每24小时检查一次若虫的存活情况，并作相应若虫的补充。分别在水稻接虫后7d和14d观察受害级别。

3）水稻植株草酸含量：水稻体内草酸含量是水稻对褐飞虱抗性高低评价的重要指标，含量越高抗性越强。

本发明的草酸含量测定采用三氯化钛显色法，取农药处理后7天的水稻植株，称重后用组织捣碎机破碎后过滤取汁，加入活性炭（加入量为原汁体积的1/4）在常温下脱色30min，然后用80-2型离心机分离活性炭，离心机转速为3000 r/min，一次脱色不完全，用同样方法进行二次脱色，待其溶液呈无色或略呈乳白色。取离心脱色过的水稻汁3ml加入1%三氯化钛溶液（分析纯）0.15ml显色，在分光光度计上于400 nm下测定吸光值，用草酸配制标准曲线，求出回归方程，由此求出草酸的含量。

4、评价结果分析

通过上述处理方法，得到了稻田两种常规农药处理后，转Bt基因水稻和亲本对照水稻对褐飞虱发生危害的影响。特分别从褐飞虱种群生命参数、水稻受褐飞虱危害级别、和水稻茎杆草酸含量三个方面分析如下：

1）褐飞虱种群生命参数：

农药处理前、后，三唑磷处理后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）上褐飞虱的种群生命参数对比结果见表1。井冈霉素处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）上褐飞虱的种群生命参数对比结果见表2。

从表1和表2中可见，在没有农药处理（CK）的情况下，转Bt基因水稻与亲本对照水稻上褐飞虱种群生命参数无明显差异，这与传统转Bt基因水稻对褐飞虱种群影响的评价结果一致，即转Bt基因水稻与非转基因水稻对褐飞虱种群的影响无明显差异。

但农药处理后，转Bt基因水稻上褐飞虱种群生长与常规水稻中褐飞虱种群生长之间开始出现差异。差异随农药处理浓度而变，尤其体现在生殖方面。如三唑磷处理80ppm时转Bt基因水稻上褐飞虱单雌产卵量显著高于非转基因水稻上（见图1、图2），在褐飞虱种群下一代发生趋势方面，三唑磷10ppm处理中，转Bt基因水稻也显著高于非转基因水稻（见图,3、4）。从而证实，井冈霉素、三唑磷两种农药处理，三唑磷对转Bt基因水稻上褐飞虱的影响更为明显。图1、2中的横坐标表示浓度，纵坐标表示单雌产卵量（粒）。

2）水稻受害级别：

参照表3和表4，在水稻受褐飞虱取食危害的对比方面，无农药处理（CK）时，转Bt基因水稻上受褐飞虱危害的级别略高于非转基因水稻，但统计分析无显著性差异。井冈霉素处理后，两种水稻上受褐飞虱危害的级别无显著差异（见表3、4），但三唑磷处理后，转Bt基因水稻受褐飞虱危害的级别较常规对照水稻有增加的趋势（见表3、4），即表明三唑磷的使用可能会增加转Bt基因水稻受褐飞虱危害的风险性。表3、4中的横坐标表示浓度，纵坐标表示种群趋势指数I。

3）水稻茎杆草酸含量：

草酸是水稻体内抗褐飞虱危害的代表性生化物质之一，其含量高低与抗性成正比关系。含量越高抗性越强。草酸含量测定采用三氯化钛显色法，取农药处理后7天的水稻植株，称重后用组织捣碎机破碎后过滤取汁，加入活性炭（加入量为原汁体积的1/4）在常温下脱色30min，然后用80-2型离心机分离活性炭，离心机转速为3000 r/min，一次脱色不完全，用同样方法进行二次脱色，待其溶液呈无色或略呈乳白色。取离心脱色过的水稻汁3ml加入1%三氯化钛溶液（分析纯）0.15ml显色，在分光光度计上于400 nm下测定吸光值，用草酸配制标准曲线，求出回归方程，由此求出草酸的含量。

参照图5、6，在无农药处理时，转Bt基因水稻与非转基因水稻茎秆内草酸含量无显著差异，即草酸水平的抗褐飞虱危害无差异。但井冈霉素、三唑磷两种农药处理后，两种水稻体内草酸含量总体呈下降趋势，其中转Bt基因水稻总体含量水平基本低于非转基因水稻。井冈霉素200ppm处理中（见图5），转Bt基因水稻体内草酸含量显著低于非转基因水稻体内的含量，即转Bt基因水稻对褐飞虱的抗性显著低于非转基因水稻，类似的显著差异还可见三唑磷20ppm和40ppm（见图6）。由此可见，在加入井冈霉素、三唑磷两种农药处理后，转Bt基因水稻对褐飞虱从草酸角度的抗性方面低于非转基因水稻，而这在传统评价技术中是不能预见的。

本发明表明，井冈霉素、三唑磷两种农药均能明显影响褐飞虱种群的生长发育和水稻体内的抗褐飞虱物质的含量，其中三唑磷对转Bt基因水稻上褐飞虱危害较非转基因水稻上有利。这些结果在传统转Bt基因水稻对褐飞虱的“一对一”效应生态评价技术中是不能反映出来的，本发明为转Bt基因水稻对非靶标重要害虫褐飞虱的发生危害生态安全评价增加了切实性。

在生产实际应用方面，由于转Bt基因水稻使用后，针对主要鳞翅目害虫控制的化学农药使用次数和使用量将明显减少，这方面农药的继续使用将起到兼治转Bt基因水稻控制较弱的鳞翅目害虫的作用。本发明也证实，三唑磷的使用浓度较低时，对转Bt基因水稻上褐飞虱发生和为害的影响与常规水稻基本无差异。因此，本发明表明转Cry2A基因水稻上对褐飞虱发生为害较为安全的三唑磷使用浓度为20ppm。

本发明在操作程序上，基于农药田间实际应用浓度，围绕褐飞虱发生危害的三个重要考察指标，在室内和半田间即可操作完成，比较易懂掌握。本发明成本方面低廉，只要有一些昆虫饲养的基本设备（养虫室、光照培养箱）和常规植物生化物质测定仪器（离心机、分光光度计）即可，易于推广使用。

表3 井冈霉素处理前、后Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）受褐飞虱危害的级别对比

 注：不同小写字母表示纵向比较中5%水平上的差异显著 （Fisher’s PLSD test）。 

表4 三唑磷处理前、后转Bt基因水稻（T2A-1）和亲本对照水稻（MH63）受褐飞虱危害的级别对比

 

注：不同小写字母表示纵向比较中5%水平上的差异显著 （Fisher’s PLSD test）。