利用RNA干扰技术研究赤拟谷盗转录因子对细胞色素P450的诱导调控作用

摘要

生命有机体，从细菌到人类，当暴露于外源物质中时均能够表现出协同的转录应答反应，通过诱导解毒酶和转运蛋白对外源物质进行代谢，细胞色素P450酶正是该解毒过程中最重要的酶系之一。在脊椎动物中，若干个转录因子已经被证实在包括P450在内的解毒酶的转录应答反应中发挥作用。然而，在昆虫尤其是在农业害虫的研究中，虽然多个P450基因已经被证实与外源化合物诱导或者抗药性产生相关，但是关于这些基因的调控因子研究者们还知之甚少。 本文构建了赤拟谷盗P450基因与其他昆虫来源的，与外源化合物诱导和抗药性相关的P450基因的进化树，进一步通过全基因序列相似性的比对，获得了8个候选的P450可诱导基因，即CYP4G7, CYP4Q4, CYP4BR3, CYP12H1，CYP6BK11，CYP9D4, CYP925和CYP345A1，以及4个潜在的转录调控基因，分别为激素受体TcHR96（hormone receptor-like96），雌激素相关受体TcERR(estrogen-relatedreceptor)，蜕皮激素诱导受体TcE75(Ecdysone-induced75 protein)以及TcCnc(cap‘n’ collar)。通过测定这两类基因在赤拟谷盗不同龄期及组织中的表达模式，选择了20天赤拟谷盗老熟幼虫作为最终的试虫，考查转录调控因子对P450诱导的影响。 在农药对P450基因的诱导研究中，选择了与昆虫解毒酶基因诱导以及抗药性产生研究较频繁的三种拟除虫菊酯农药氯氰菊酯，三氟氯氰菊酯，氯菊酯以及新烟碱类农药吡虫啉共四种药物。经生物测定，我们采用了LC20值作为初始处理浓度，并通过qRT-PCR鉴定了TcCYP4G7，TcCYP4BR3以及TcCYP345A1三个基因于不同农药处理时，在mRNA水平上可以显著诱导上调。在比较确认了致死浓度长时间处理(LC20处理24h)以及亚致死浓度短时间处理(1/4LC20处理6h)两种试验条件对于诱导水平无显著差异后，我们最终以后者作为农药诱导的优化处理条件。 利用RNA干扰（RNAi）技术，将转录调控因子分别沉默后，首先观察其表型的变化，结果发现沉默TcE75和TcCnc基因将导致幼虫和蛹均无法羽化，而沉默TcHR96和TcERR则不会产生显著的致死效应，这些现象首先表明了这些候选转录因子在赤拟谷盗生长发育方面的功能，揭示了调控因子功能的多样性。更进一步地，采用不同农药处理试虫（优化的诱导条件），并考查P450基因的mRNA表达水平的变化。对于4个候选的转录调控基因，仅发现当TcCnc的功能受抑制后，原先被正常诱导的P450基因不能够被诱导，说明该基因在赤拟谷盗P450基因诱导的转录调控中发挥了重要功能。此外，进一步通过生物测定发现当该基因被抑制后，试虫对不同农药的敏感性显著增强，基因沉默-诱导消失-敏感性增强，这一系列试验现象进一步为TcCnc的调控因子功能提供了强有力的证据。 本研究首次发现了TcCnc基因是赤拟谷盗P450基因诱导的转录调控因子，这为进一步探索TcCnc参与的信号通路在害虫抗性品系中是否被大量激活，是否在害虫抗药性的获得过程中发挥关键作用提供了研究基础，也为基于该调控通路的新农药的研发，新的害虫防治手段的运用提供了重要理论支持。

目录

声明

术语和缩略语表

摘要

第一章 前言

1．细胞色素P450概述

1．1 细胞色素P450酶的由来

1．2 细胞色素P450的命名

1．3 细胞色素P450的蛋白结构

2．P450酶的催化机制

3．昆虫P450基因的多样性

4．昆虫细胞色素P450的功能

5．细胞色素P450的诱导

5．1 能够诱导昆虫P450的外源化合物

5．2 昆虫P450基因诱导的研究方法

6．细胞色素P450的诱导与抗药性的产生

6．1 细胞色素P450与昆虫抗药性的关系研究进展

6．2 P450基因的诱导与抗药性的关系

7．P450基因的转录调控因子研究

7．1 哺乳动物对P450基因的诱导机制

7．2 Nrf2基因对P450的诱导调控

7．3 昆虫P450基因的诱导调控因子研究

8．P450基因转录调控因子功能研究方法

8．1 构建转基因品系

8．2 利用RNAi技术抑制潜在转录因子的功能

8．3 利用转录组测序信息研究转录因子功能

8．4 报告基因方法研究转录因子功能

9．本研究的理论依据、目的及研宄内容

9．1 本研究开展的理论依据

9．2 本论文研究目的

9．3 本论文研究内容

第二章 赤拟谷盗可诱导P450基因和转录调控因子的筛选

1．试验方法

1．1 赤拟谷盗各个clan系统发育树的构建

1．2 赤拟谷盗候选P450基因及调控因子的筛选

2．试验结果分析

2．1 赤拟谷盗全P450基因的标注及系统发育树的构建

2．2 赤拟谷盗与其他昆虫P450基因的进化树分析

2．3 赤拟谷盗可诱导P450基因的筛选

2．4 赤拟谷盗P450基因调控因子的筛选

3．讨论和小结

3．1 讨论

3．2 小结

第三章 赤拟谷盗P450基因及转录调控因子的分子特性及农药诱导模式分析

1．试验方法

1．1 供试虫源及饲养

1．2 试剂与试剂盒

1．3 试剂的配制

1．4 主要仪器

1．5 引物设计

1．6 总RNA的提取与cDNA第一链的合成

1．7 PCR扩增、产物回收纯化、连接及转化

1．8 克隆PCR和质粒提取

1．9 不同发育期、不同组织P450基因表达量测定

2．1 赤拟谷盗P450和转录调控基因的表达模式研究

3 结果与分析

3．1 总RNA的提取

3．2 赤拟谷盗CYP基因的CDS序列及推导的蛋白序列

3．3 赤拟谷盗及其他物种对应的转录调控因子的氨基酸序列比对结果

3．4 不同发育期，不同组织的P450基因和转录调控基因的表达量测定

3．5 不同发育期转录调控基因表达的相对定量qRT-PCR测定

3．6 不同组织转录调控基因表达的半定量RT-PCR测定

4 赤拟谷盗P450和转录调控基因在外源化合物胁迫下的表达模式

4．1 不同农药对赤拟谷盗的生物测定结果

4．2 赤拟谷盗诱导的P450基因及转录调控因子的鉴定

4．3 P450基因诱导的浓度和时间效应

5 讨论和小结

5．1 讨论

5．2 小结

第四章 RNAi技术初步揭示赤拟谷盗的转录调控因子功能

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要仪器设备和试剂

1．3 含T7启动子的模板DNA制备

1．4 dsRNA的制备

1．5 显微注射

1．6 赤拟谷盗幼虫转录调控因子的RNA干扰效应

1．7 赤拟谷盗蛹转录调控因子的RNA干扰效应

1．8 赤拟谷盗转录调控因子对P450基因诱导的影响研究

1．9 转录调控基因抑制后赤拟谷盗对农药敏感度的变化研究

2．0 数据分析

2 结果分析

2．1 dsRNA的合成

2．2 qPCR检测试虫注射dsRNA后基因mRNA水平的沉默效果

2．3 沉默转录调控基因对赤拟谷盗生长发育的影响

2．4 赤拟谷盗转录调控因子对P450基因诱导的影响研究

2．5 转录调控基因抑制后赤拟谷盗对农药敏感度的变化

3．讨论和小结

3．1 讨论

3．2 小结

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 本研究创新之处

5．3 不足与展望

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文