菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞肽聚糖识别蛋白和抗菌肽基因的克隆与功能初探

摘要

寄生蜂利用多种寄生因子对寄主的免疫系统、生长发育及营养代谢进行调控，为幼蜂提供良好的生长发育环境。作为主要寄生因子之一的畸形细胞，来源于寄生蜂胚胎的浆膜层细胞，幼蜂孵化时被释放到寄主血腔中，在调控寄主生长发育和营养代谢等生理过程中发挥了重要作用。抗菌肽是昆虫先天免疫系统中非常重要的一类效应分子，是昆虫受到外界微生物侵害时，昆虫体内一些组织或器官中大量迅速合成并释放出具有生物活性的物质，能杀死细菌、真菌、病毒甚至肿瘤细胞。本论文首先在筛选出18个菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞免疫相关基因EST序列的基础上，克隆了其中6个免疫相关基因，并测定了它们在不同微生物诱导下的转录模式;其次，对菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞所产生抗菌肽的抑菌活性以及畸形细胞与寄主感菌后死亡率的关系进行了初步研究。现将研究结果总结如下:
　　(1)免疫相关基因的筛选与验证
　　根据菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞转录组中基因注释的结果，结合生物信息学分析，筛选出可以匹配到已知的10个免疫相关基因家族的18个EST序列。通过反转录PCR(RT—PCR)验证了其中包括防御素defensin、溶菌酶lysozyme、膜翅肽hymenoptaecin、肽聚糖识别蛋白peptidoglycan-recognition protein(PGRP)等在内的15个基因。
　　(2)菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞肽聚糖识别蛋白和抗菌肽基因的克隆与序列分析
　　通过RACE等技术手段，获得了包括菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞防御素(CvTdef)、菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞肽聚糖识别蛋白(CvTpgrp)和菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞甲壳肽（CvTcru）在内的3种免疫相关基因家族的6条cDNA全长序列。其中，CvTdef-A含有长度为369bp的开放阅读框(ORF)，编码1个123个氨基酸残基的蛋白，预测分子量大约为13.25kDa;CvTdef-B含有长度为222bp的开放阅读框，编码1个74个氨基酸残基的蛋白，预测分子量大约为7.97kDa; CvTdef-C含有长度为237bp的开放阅读框，编码1个79个氨基酸残基的蛋白，预测分子量大约为8.56kDa; CvTpgrp-SA含有长度为336bp的开放阅读框，编码1个112个氨基酸残基的蛋白，预测分子量大约为12.69kDa; CvTpgrp-LC含有长度为525bp的开放阅读框，编码1个175个氨基酸残基的蛋白，预测分子量大约为35.29kDa;CvTcru含有长度为426bp的开放阅读框，编码1个142个氨基酸残基的蛋白，预测分子量大约为16.39kDa。序列分析结果表明:CvTdef-A、CvTdef-B、CvTdef-C均含有信号肽序列和6个保守的半胱氨酸位点。
　　(3)微生物诱导下菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞肽聚糖识别蛋白和抗菌肽基因的转录模式
　　在菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞体外培养的体系中加入热灭活的大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和白色念珠菌Monilia albican进行体外免疫诱导。诱导6h、12h、24h、48h后提取各种处理条件下畸形细胞的总RNA并合成cDNA，以荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测CvTdef、 CvTpgrp和CvTcru的转录水平。经大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌诱导处理后，6个基因的转录水平明显地提高并随着诱导时间的延长而继续上升，而这种转录水平上升的幅度是诱导早期高于诱导晚期。不同菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞肽聚糖识别蛋白和抗菌肽基因的转录水平与不同微生物诱导的相关性不同:CvTde-A、CvTde-B、CvTde-C和CvTpgrp-SA经细菌诱导后转录水平均显著高于真菌诱导后的转录水平，CvTpgrp-LC在细菌、真菌诱导后转录水平较为接近;CvTcru经革兰氏阳性菌诱导后的转录量上升水平高于革兰氏阴性菌和真菌诱导。比较3个CvTdef在不同微生物诱导后的转录水平，从高到低依次为CvTdef-C＞CvTdef-B＞ CvTdef-A。CvTpgrp-LC在3种微生物诱导的转录水平均高于CvTpgrp-SA。
　　(4) CvTdef-A的抑菌活性及畸形细胞与寄主幼虫感菌后死亡率的关系初探
　　以菌液生长曲线测定法测定了人工合成的CvTdef-A多肽的抑菌活性，结果表明CvTdef-A多肽对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长都具有抑制作用，且对于大肠杆菌生长的抑制作用强于对枯草芽孢杆菌生长的抑制作用。
　　通过比较菜蛾盘绒茧蜂雌蜂正常寄生、辐射不育菜蛾盘绒茧蜂雌蜂假寄生和未寄生的小菜蛾3龄中期幼虫在大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa、、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、白僵菌Beauveria bassiana这6种致病菌感染后的死亡率的方法，研究了菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞和寄主感菌后死亡率的关系。结果表明在各种微生物感染条件下，小菜蛾幼虫的死亡率均是未寄生＜正常寄生＜假寄生。

目录

声明

论文说明

致谢

前言

摘要

第一章 文献综述

1 畸形细胞的概念

1．1 畸形细胞的起源

1．2 畸形细胞的数量和形态

2 畸形细胞的功能

2．1 畸形细胞的营养功能

2．2 畸形细胞调控寄主发育功能

2．3 畸形细胞抑制寄主的免疫系统

3 昆虫抗首肽的概念

4 昆虫抗菌肽的分类

4．1 天蚕素类

4．2 富含半胱氨酸的抗菌肽

4．3 富含脯氨酸的抗菌肽

4．4 富含甘氨酸的抗菌肽

5 昆虫抗菌肽的作用机制

6 肽聚糖识别蛋白的概念

第二章 基本材料与方法

1 养虫设备

1．1 全自动人工气候室

1．2 智能人工气候箱

1．3 养虫笼

1．4 产卵笼

1．5 保蜂盒及寄生盒

1．6 吸虫管

2 供试材料

2．1 供试蔬菜

2．2 供试菌种

3 供试昆虫的人工饲养

3．1 虫源

3．2 小菜蛾的饲养

3．3 寄生蜂的饲养

4 实验仪器及软件系统

4．1 实验仪器

4．2 软件系统

5 常用实验试剂及配制

5．1 工具酶及试剂盒

5．2 其它试剂

5．3 一般试剂的配制

6 常规实验方法

6．1 菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞的收集

6．2 TRIzol法提取总RNA

6．3 cDNA第一链的合成

6．4 PCR反应

6．5 感受态细胞的制备

6．6 琼脂糖凝胶电泳

6．7 凝胶回收目的片段

6．8 连接反应

6．9 转化与活化

6．10 质粒提取

6．11 3’、5’末端快速扩增(RACE)

6．12 荧光定量PCR(qRT-PCR)

6．13 试验菌液的制备

第三章 菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞免疫相关基因的筛选与验证

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 畸形细胞的体外诱导

1．3 合成cDNA文库

1．4 片段序列扩增及鉴定

1．5 生物信息学分析

2 结果

2．1 免疫相关基因的筛选

2．2 部分免疫相关基因的验证

第四章 畸形细胞肽聚糖识别蛋白和抗首肽基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞的收集

1．3 畸形细胞RNA的提取及cDNA第一链的合成

1．4 畸形细胞的体外诱导

1．5 引物设计

1．6 RACE

1．7 产物纯化、连接T载体及鉴定

1．8 生物信息学分析

2 结果与分析

2．1 PGRP和defensin基因的序列分析

2．2 氨基酸序列的同源进化分析

3 讨论

第五章 微生物诱导下畸形细胞肽聚糖识别蛋白和抗菌肽基因的转录模式

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞的收集与体外诱导

1．3 畸形细胞RNA的提取及cDNA第一链的合成

1．4 实时荧光定量(qRT-PCR)检测

2 结果与分析

2．1 引物的特异性和扩增效率

2．2 畸形细胞肽聚糖识别蛋白和抗菌肽在微生物诱导后的转录模式

3 讨论

第六章 畸形细胞抗菌肽的抑菌活性及与寄主幼虫死亡率关系的初探

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 CvTdef-A多肽合成

1．3 抑菌试验

1．4 辐射处理雌蜂及其假寄生

1．5 小菜蛾感菌能力研究

2 结果与分析

2．1 CvTdef-A抑茵效果的检测

2．2 畸形细胞与寄主感菌后死亡率的关系

3 讨论

第七章 总结

参考文献