蜂王浆主蛋白(MRJPs)替代牛血清(FBS)培养人体细胞应用技术研究

摘要

蜂王浆(royal jelly，RJ)是由5～15日龄成年工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺分泌的粘稠状物质，营养丰富，是蜂王的终生食物，对人体具有多种营养保健功能。新鲜蜂王浆含水分60～70％、蛋白质12～15％、碳水化合物10％～16％、脂类3％～6％，以及少量维生素、矿物质、游离氨基酸等。MRJPs(major royal jellyproteins)是蜂王浆中水溶性蛋白的总称，约占王浆总蛋白的82％～90％。近年研究证明，MRJPs是决定蜜蜂发育为蜂王的关键活性成分。本文研究了MRJPs对5种人体细胞的促生长作用及初步作用机理，MRJPs与胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)及细胞因子复配和替代FBS培养人体细胞的应用技术，以及进一步添加细胞生长因子的效果。
　　1.MRJPs对Chang Lvier细胞的促增殖作用及作用机理将MRJPs添加到细胞培养基，用MTT法比较纯MRJPs与FBS、不同MRJPs/FBS比例对张氏肝细胞(Chang Liver)增殖的影响，再用流式细胞仪检测MRJPs各处理对细胞周期的影响。结果表明:仅添加MRJPs不能促进细胞增殖，完全培养基(10％ FBS)中MRJPs的最佳添加量为0.5 mg/mL; MRJPs(5 mg/mL)/FBS的添加比例为60/40的混合培养基的效果最佳，其对细胞的促增殖作用与完全培养基相比无显著差异(p＜0.05)。流式细胞仪检测显示，MRJPs与FBS配合使用可促使细胞S期及G0/G1期比例增大，推测其作用可能与促进DNA合成、前期RNA和核糖体合成有关。
　　2.MRJPs与胎牛血清复配对4种人体细胞的促生长作用用初始浓度为5 mg/mL的MRJPs母液，按不同比例(30％、60％、90％)替代FBS添加到培养基中培养293T、HCT116、231及HFL-Ⅰ细胞。以10％FBS为阳性对照组、10％PBS为阴性对照组，5～8天后用MTT法检测各处理的相对活细胞数。结果显示，适用于Chang Liver细胞的最佳MRJPs/FBS比例(60/40)也适用于293T、HCT116及HFL-Ⅰ细胞，用该比例配方血清培养的三种细胞相对活细胞数最高，与全FBS培养无显著差异，或显著高于全FBS组。然而，该复合血清对231细胞无显著促增殖效果，第5天时的相对活细胞数仅占全FBS的34.4％，说明该复合血清对细胞的促增殖作用对细胞具有选择性。
　　3.MRJPs/FBS复合血清中添加细胞因子对5种人体细胞的促生长作用在比例为60/40的MRJPs/FBS复合血清中添加不同组合形式的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素铁硒传递蛋白(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)及地塞米松（Dexamethasone，DSMS），用于培养Chang Liver、293T、HCT116、231及HFL-Ⅰ细胞，其中FBS为阳性对照（不含细胞生长因子），不含细胞生长因子的MRJPs/FBS复合血清为阴性对照。3～8天后用MTT法检测相对活细胞数。结果显示，复合血清中添加EGF和ITS的混合物能显著促进Chang Liver、293T、HCT116及HFL-Ⅰ细胞增殖（相对于阴性对照组），同时这些细胞株的相对活细胞数均显著大于阳性对照组(FBS);复合血清中添加DSMS对各种细胞均无显著促增殖作用;添加细胞因子也不能促进231细胞增殖，其相对活细胞数低于阳性对照组(FBS)50％，且细胞不能正常贴壁。
　　本研究证明，MRJPs可部分替代FBS用于人体细胞培养，具有促生长活性;筛选出了适宜用MRJPs/FBS复合血清培养的四种细胞，得到了优化配方和适宜的细胞生长因子，为王浆的开发利用提供了新的技术用途。

目录

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致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 MRJPs家族成员及结构

1．2 MRJPs制备方法

1．2．1 超速离心法

1．2．2 离心透析法

1．2．3 碱提酸沉法

1．2．4 盐提酸沉法

1．2．5 层析法

1．2．6 电泳法

1．2．7 高校液相色谱法

1．3 MRJPs的生理活性

1．3．1 MRJP1是蜜蜂级型分化的关键因子

1．3．2 抗疲劳作用

1．3．3 免疫调节作用

1．3．4 血管舒张及降压作用

1．3．5 促进伤口愈合

1．3．6 促进细胞生长

1．4 哺乳动物细胞无血清培养现状

1．4．1 无血清培养基的发展和研究进展

1．4．2 无血清培养基的主要补充因子

1．4．3 无血清培养基展望

1．5 研究目的、意义及内容

1．5．1 研究目的和意义

1．5．2 研究内容

第二章 王浆主蛋白对张氏肝细胞的促增殖作用及机理研究

2．1 材料、试剂和设备

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验设备

2．2 实验方法

2．2．1 MRJPs制备

2．2．2 凯氏定氮法测定MRJPs提取液浓度

2．2．3 MRJPs有效浓度筛选

2．2．4 MRJPs与BSA对细胞增殖的影响比较

2．2．5 MRJPs对细胞增殖影响的测定

2．2．6 不同比例MRJPs／FBS混合液对细胞增殖的影响

2．2．7 不同比例MRJPs／FBS混合液对细胞周期的影响

2．2．8 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 促进细胞增殖的MRJPs浓度筛选

2．3．2 MRJPs与BSA对细胞增殖影响的比较

2．3．3 MRJPs对细胞增殖的影响

2．3．4 不同比例MRJPs／FBS混合液对细胞增殖的影响

2．3．5 不同比例MRJPs／FBS混合液对细胞周期的影响

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 王浆主蛋白替代牛血清培养人体细胞优化技术研究

3．1 材料、试剂和设备

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验设备

3．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 不同比例MRJPs／FBS混合液对293T细胞增殖的影响

3．3．2 不同比例MRJPs／FBS混合液对HCT116细胞增殖的影响

3．3．3 不同比例MRJPs／FBS混合液对HFL-I细胞增殖的影响

3．3．4 不同比例MRJPs／FBS混合液对231细胞增殖的影响

3．4 讨论与小结

第四章 MRJPs／FBS复合血清中添加细胞因子培养人体细胞技术研究

4．1 材料、试剂和设备

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 实验设备

4．2 方法

4．2．1 含细胞因子复合血清的配制

4．2．2 细胞培养

4．3 结果与分析

4．3．1 复合血清中添加细胞因子对Chang Liver细胞增殖的影响

4．3．2 复合血清中添加细胞因子对231细胞增殖的影响

4．3．3 复合血清中添加细胞因子对293T细胞增殖的影响

4．3．4 复合血清中添加细胞因子对HCT116细胞增殖的影响

4．3．5 复合血清中添加细胞因子对HFL-I细胞增殖的影响

4．4 讨论和小结

第五章 结论及展望

5．1 主要研究结论

5．2 主要创新点

5．3 研究展望

参考文献

作者简介及科研成果