纳米硒对雄性SD大鼠抗氧化、生殖功能的影响及毒性机理研究

摘要

本课题应用纳米技术成功构建了以壳聚糖为模板的硒纳米微粒(SeNPs)，并通过TEM、AFM、SEM、红外光谱等各种技术手段对其进行表征，证实制备得到了平均粒径为79.88 nm，表面电荷为+29 mV的分布均匀、大小较一致的近圆形的较为稳定的纳米颗粒。在此基础上，应用制备得到的纳米硒，以雄性SD大鼠为试验动物，通过活体灌胃、肝细胞培养等三个试验，研究了SeNPs对雄性大鼠抗氧化、生殖功能的影响及毒性机理。初步探讨超营养剂量即高于营养剂量的SeNPs的添加对雄性大鼠抗氧化和生殖功能的影响，筛选出最优的添加剂量。并在毒性剂量下研究SeNPs在体内的生物学效应和作用靶器官，通过细胞活性测定、流式细胞凋亡和相关凋亡蛋白表达水平等手段检测SeNPs对体外培养肝细胞的毒性作用机理，为SeNPs的临床和生产中应用提供理论参考。
　　试验一:选择40只5周龄的健康雄性SD大鼠，分4组，分别灌服0、0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs，每天一次，连续灌胃两周，试验结束后麻醉处死，取相关样品进行分析检测。结果表明:
　　(1)灌胃超营养剂量的SeNPs两周后，0.2、0.4 mg/kg BW的SeNPs促进了大鼠的生长，而0.8mg/kg BW的SeNPs对体重没有产生显著影响。
　　(2)0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs灌胃处理组的IgG水平均较对照组显著升高。0.8 mg/kgBW SeNPs处理组的IgM水平较对照组有显著升高。0.4 mg/kgSeNPs组的C3、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ均较对照组有显著升高，0.8 mg/kgSeNPs组的C3、C4和IL-2也较对照组有显著升高。因此三个剂量SeNPs对大鼠的免疫功能均有不同程度的促进作用，且以0.4 mg/kg SeNPs组最为显著。
　　(3)0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs处理均显著提高了血清中RT3、FT3的水平，而对血清中FT4和TSH的水平没有显著影响。此结果揭示了在超营养剂量下，SeNPs对于甲状腺功能有促进作用。
　　(4)对血清中抗氧化指标的检测结果显示，0.8 mg/kg剂量组的T-GSH值较对照组显著升高，0.2、0.4 mg/kg剂量组H2O2的值较对照组显著降低，而三个剂量组其他指标没有显著影响。本研究结果揭示了在超营养水平下，SeNPs对血清的抗氧化能力提高的程度不太明显，但有改善的趋势，且有剂量依赖性。
　　而对不同组织中抗氧化功能的检测结果显示，灌胃超营养剂量的SeNPs使肝脏和肾脏的抗氧化能力有所提高，且提高的幅度以肾脏较为明显，而对于心脏和睾丸的影响较小，因此，纳米硒对于各组织脏器的抗氧化反应具有组织差异性。
　　(5)0.8 mg/kgBW剂量组肺脏的湿重较对照组有显著升高，且肺脏指数也较对照组显著升高;其他各脏器指数与对照组均无显著差异。可以推测0.8mg/kgBW SeNPs对于肺脏产生了一定的毒性作用。
　　(6)对大鼠繁殖性能的研究结果显示，0.2、0.4 mg/kgBW SeNPs组血清中睾酮含量较对照组没有显著差异，而0.8 mg/kgBW SeNPs处理组较对照组显著升高，说明其促进了睾酮的分泌。三个剂量组的SeNPs对于睾丸组织中LDH、ACP、AKP酶的活性均没有产生显著的影响。对精子活力和精子运动参数的检测结果显示，0.8 mg/kgBW SeNPs以下的处理剂量对于精子的活力和运动力有很好的促进作用。
　　(7)0.2、0.4、0.8mg/kg灌胃剂量的SeNPs使肝脏中GPX1和GPX4的mRNA表达量均较对照组极显著升高，但对睾丸中GPX1和GPX4的基因表达没有显著影响，说明SeNPs对不同器官组织的作用存在组织差异。
　　试验二:选择40只6周龄的健康雄性SD大鼠，分4组，分别灌服0、2.0、4.0、8.0 mg/kgBW SeNPs，每天一次，连续灌胃两周，试验结束后麻醉处死，取相关样品进行分析检测。结果显示:
　　(1)灌胃毒性剂量的SeNPs两周后，2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs均显著抑制了大鼠的生长，而且血清中肝功能指标显著升高，显示三个剂量均对大鼠产生了一定的毒性作用，且对肝脏造成了一定程度的损伤。
　　(2)灌胃2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs两周，对大鼠的甲状腺功能没有显著性影响，4、8 mg/kgBW的SeNPs使外周血T淋巴细胞和脾脏T淋巴细胞增殖显著降低，即4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs使大鼠免疫功能受损，而2.0mg/kgBW的SeNPs则使血清中IgM、IgG、IL-6均有显著升高。
　　(3)灌胃8.0 mg/kgBW剂量的SeNPs使血清、肝脏、肾脏、心脏和睾丸组织的抗氧化能力明显降低，4.0 mg/kgBW剂量的SeNPs也使血清、肝脏、心脏的抗氧化功能受到不同程度损伤，抗氧化能力降低，体内的过氧化产物升高。并且从抗氧化指标来看，大鼠的睾丸组织较其他组织对于过量的SeNPs的耐受性稍强，其次是肾脏、心脏。肝脏对于SeNPs的毒性最敏感。
　　(4)对脏器指数的检查结果显示:在8 mg/kgBW处理组的毒性剂量下肝脏、肾脏、肺脏和脾脏指数均较对照组显著升高，而心脏指数、睾丸指数和胸腺指数则较对照组显著降低，2 mg/kgBW处理剂量下的肝脏指数和肾脏指数也较对照组显著升高，4 mg/kgBW处理剂量下的肾脏指数显著升高，而胸腺指数显著降低。
　　对脏器组织的病理检查结果显示:在8 mg/kgBW处理组的毒性剂量下，肝脏出现细胞坏死、崩解，肝窦内皮细胞肿胀，有少量淋巴细胞样细胞浸润;肾脏中肾小球萎缩并且有渐进性细胞坏死的发生;肺泡内有充血，且支气管腔上皮内膜增厚;胸腺的髓质和皮质界限不清晰，以及有炎症细胞的大量浸润;睾丸组织中曲细精管大部分退化萎缩，曲细精管管壁明显变薄甚至破裂，细胞层次减少，生精小管直径变小，各级生精细胞排列紊乱甚至缺失。2、4 mg/kgBW处理组的组织病理图片较对照组没有显著变化。
　　对肝脏和睾丸的电镜检查发现，8 mg/kgBW处理组的肝脏和睾丸细胞的细胞间界限模糊，细胞核变形，细胞内染色质浓染、边聚，呈现细胞凋亡的形态。
　　利用TUNEL法检测肝细胞的凋亡指数，结果显示2、4、8 mg/kg BW SeNPs处理组的凋亡细胞明显较对照组多，且4、8 mg/kg BW SeNPs处理组的凋亡指数较对照组均有极显著的升高。
　　(5)对精子质量的检查发现，精子的各项运动参数有不同程度降低，但显著提高了睾丸组织中GPX1和GPX4的基因表达量。
　　试验三:以0.1、0.5、1.0、12.0、24.0、48.0μM六个不同浓度的SeNPs对BRL细胞进行培养，结果显示:
　　(1)0.1、0.5、1.0、12.0μM浓度处理组的SeNPs对细胞活性有促进作用，而超过24.0μM浓度的SeNPs则对细胞活性有损害。
　　(2)不同浓度SeNPs对细胞内抗氧化活性的研究结果发现，0.1、0.5、1、12μM浓度处理组的GSH-Px、SOD、T-AOC的值均较对照组有不同程度的升高，而超过24μM浓度的SeNPs使细胞内的GSH-Px和T-AOC的值显著降低，MDA的值显著升高。即大于24μM浓度的SeNPs对细胞内的抗氧化活性有损害。
　　(3)进一步研究不同水平SeNPs对细胞凋亡的影响，结果显示，24.0μM和48.0μM浓度的SeNPs显著提高了BRL细胞的早期凋亡和晚期凋亡率，使与诱导凋亡的关键蛋白Caspase3和Caspase8的活性显著升高，而对P53的基因表达水平没有显著影响。
　　综合上述研究结果得出:0.2和0.4 mg/kg剂量的SeNPs对大鼠的生长、免疫、甲状腺功能以及抗氧化功能有不同程度的促进作用，显著提高了雄性大鼠的生殖功能，其中以0.4 mg/kgBW剂量最为显著，肝脏中GPX1和GPX4的基因表达显著上升;而灌胃2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs对大鼠生长有抑制作用，免疫功能和甲状腺功能受损，抗氧化能力也有不同程度降低，8.0 mg/kgBW的SeNPs肝脏、肾脏、肺、胸腺和睾丸组织都产生了不同程度的病理损伤，且能诱导肝脏细胞的凋亡，精子的各项运动参数也有不同程度降低。对于肝细胞培养的研究发现，SeNPs可能是通过诱导凋亡的关键蛋白Caspase3和Caspase8的表达的途径来诱导肝细胞凋亡的。

目录

声明

英文缩略词

摘要

第一章 文献综述和研究思路

1．1 硒的化学形式

1．1．1 硒的存在形式

1．1．2 饲料原料中的硒含量及其存在形式

1．2 硒在动物体内的吸收、代谢途径

1．2．1 硒的吸收

1．2．2 硒的代谢过程

1．2．3 硒在机体内的排泄

1．3 硒的生物学功能

1．3．1 硒蛋白

1．3．2 硒的抗氧化应激功能

1．3．3 硒与免疫

1．3．4 硒对动物繁殖功能的影响

1．3．5 硒对雄性动物生殖的影响

1．3．6 硒对雌性动物繁殖性能的影响

1．3．7 硒的抗癌作用

1．3．8 硒的其他生理功能

1．4 硒的毒性

1．4．1 硒对不同动物的毒性作用

1．4．2 不同形式硒的毒性作用

1．4．3 硒的毒性机理

1．4．4 硒与细胞凋亡

1．5 SeNPs的研究进展

1．5．1 SeNPs的制备方法研究进展

1．5．2 SeNPs的生物学功能

1．5．3 纳米材料的毒性

1．6 本论文的研究思路

1．7 本课题的研究内容

第二章 SeNPs的制备与表征

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂与仪器

2．1．2 SeNPs的制备方法

2．1．3 SeNPs的表征

2．2 结果与讨论

2．2．1 粒径与表面电荷分析

2．2．2 表面形态分析

2．2．3 红外光谱分析

2．3 小结

第三章 SeNPs在超营养剂量下对雄性SD大鼠生长、免疫、生殖和抗氧化功能的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要仪器

3．1．3 试验动物与试验设计

3．1．4 样品的检测

3．1．5 数据处理

3．2 结果与讨论

3．2．1 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠增重的影响

3．2．2 不同灌胃剂量的SeNPs对血清生化指标的影响

3．2．3 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠免疫功能的影响

3．2．4 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠甲状腺激素代谢的影响

3．2．5 不同灌胃剂量的SeNPs对血清和组织抗氧化能力的影响

3．2．6 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠脏器湿重和脏器指数的影响

3．2．7 不同灌胃剂量的SeNPs对雄性大鼠繁殖功能的影响

3．2．8 不同灌胃剂量的SeNPs对肝脏和睾丸组织中GPX1和GPX4表达水平的影响

3．3 小结

第四章 SeNPs在毒性剂量下对雄性SD大鼠免疫、生殖和抗氧化功能的影响及毒性机理研究

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 主要仪器

4．1．3 试验动物与试验设计

4．1．4 样品的检测

4．1．5 数据处理

4．2 结果与讨论

4．2．1 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠增重的影响

4．2．2 不同灌胃剂量的SeNPs对血清生化指标的影响

4．2．3 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠免疫功能的影响

4．2．4 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠甲状腺激素代谢的影响

4．2．5 不同灌胃剂量的SeNPs对血清和组织抗氧化能力的影响

4．2．6 不同灌胃剂量的SeNPs对大鼠脏器损伤的影响

4．2．7 不同灌胃剂量的SeNPs对雄性大鼠繁殖功能的影响

4．2．8 不同灌胃剂量的SeNPs对肝脏和睾丸组织中GPX1和GPX4表达水平的影响

4．3 小结

第五章 SeNPs对BRL细胞活性、抗氧化能力以及毒性作用机理的研究

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 实验方法

5．1．3 数据统计

5．2 结果与讨论

5．2．1 不同处理浓度SeNPs对BRL细胞活性的影响

5．2．2 不同处理浓度SeNPs对BRL细胞抗氧化活性的影响

5．2．3 不同处理浓度SeNPs对BRL细胞凋亡的影响

5．3 小结

第六章 提示与创新点

6．1 提示

6．2 创新点

6．3 后续研究展望

参考文献

攻读博士期间发表的与学位论文相关的文章

致谢